Box-Behnken中心组合设计优化复合豆浆酒发酵工艺

周书来，王 琪，刘琨毅*，张婉琪，吴 丽

（1.乐山职业技术学院 药学系，四川 乐山 614000；2.宜宾职业技术学院 五粮液技术学院，四川 宜宾 644003；3.乐山丰野农业科技有限责任公司，四川 乐山 614000；4.乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）

我国传统的乳酒都是以马奶或羊奶为原料，以开菲尔粒或酵母菌与乳酸菌的混合菌为发酵剂生产的一类含酒精的饮品[1-4]。市场上销售的乳酒，往往存在酸度普遍偏高的不良特性[5-8]。利用豆类原料制得的豆浆与马奶或羊奶相比，含有较为丰富的植物蛋白质及营养物质，是马奶或羊奶理想的替代品，也是近年来研究的热点[9-11]。豆浆酒作为一种含有酒精的复合饮料，既补充了我国居民因牛乳等动物蛋白摄入不足的缺陷，又比传统的乳酒口感更加柔和[12-14]。

复合型发酵酒是使用两种或两种以上的酿酒原料发酵而成的酒品，其能综合两种或两种以上原料的特点与优势，弥补利用单一原料酿酒在色、香、味上的欠缺和营养成分不足等缺陷[15-16]。因复合型发酵酒利用了多种酿造原料，并采用先进的酿造工艺，使其风味独特，深受消费者的喜爱[8，16]。黄豆因其含有丰富的蛋白质、微量元素及异黄酮类物质，因而成为制作豆浆的主要原料[17]。然而，传统豆浆中存在的豆腥味极大限制了其应用和推广[18-19]。绿豆是我国传统药食兼用的食材，有“食中佳品，济世长谷”之美称，具有清热、消暑、解毒、保肝等功能。虽然传统煮制工艺中绿豆溶出物含量较黄豆低，但其豆腥味却没有黄豆浆明显[20-21]。符桢华等[13]利用豆浆制作的豆浆酒能在一定程度上消除豆浆制品豆腥味，为豆类原料制作酒类产品提供了新的思路。

本试验以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为发酵剂，通过黄豆浆与绿豆浆混合发酵酿造复合豆浆酒，利用单因素试验及响应面试验对其发酵工艺进行优化，以期酿出风味独特、酒体圆润、诸味协调的复合豆浆酒，为工业化生产提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）沪酿2.069：宜宾职业技术学院菌种保藏中心；黄豆、绿豆、白砂糖：市售；冰乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢钠、氢氧化钠（均为分析纯）：湖北鑫润德化工有限公司；亚硫酸钠（分析纯）：南京试剂有限公司；硫酸铜、酒石酸钾钠（均为分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；次甲基蓝（指示剂）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

JYL-C91T型豆浆机：九阳股份有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台：苏州净化设备有限公司；FA20043型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管离心机：郑州长城工贸有限公司；MC-GNP-9080系列隔水式恒温培养箱：青岛明成环保科技有限公司；DSX-280A型不锈钢手提式灭菌器：上海申安医疗器械厂；KL-30-10000型乳化均质机：上海科劳机械设备有限公司；BCD-2HBSA型电冰箱：青岛海尔股分有限公司；PHs-3c型精密pH计：上海理达仪器厂；AT6000型酒精度测试仪：意大利盖博分析仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 复合豆浆酒酿造工艺流程及操作要点

操作要点：挑选颗粒成熟饱满的黄豆和绿豆，去除其中的杂质，清水洗净后用5倍质量的清水浸泡9～12 h；将浸泡好的黄豆和绿豆分别加水磨浆过滤后，以黄豆浆为基准，添加一定比例的绿豆浆，并添加一定比例的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，利用柠檬酸盐缓冲液调节pH为6.5，搅拌至白砂糖完全溶解，加热至60℃，采用乳化均质机（压力为15MPa）均质，均质后在95℃条件下加热杀菌5min；待样品冷却后，在无菌条件下接入一定量的经活化后的酵母菌悬液，25℃条件下发酵，待发酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24h。

1.3.2 理化指标测定方法[22]

总糖含量（以葡萄糖计）测定：斐林试剂法；酒精体积分数测定：密度瓶法；总酸含量测定：电位滴定法；氨基酸态氮含量测定：甲醛滴定法。

1.3.3 感官评价

邀请13位教师及实验员组成评定小组，明确感官评定的指标和注意事项。参照符桢华等[13-14]对豆浆酒的研究方法及GB/T 23546—2009《奶酒》标准[22]从色泽、组织形态、香气、滋味、典型性5个方面制定复合豆浆酒感官评价标准，满分为100分，评价标准如表1所示。

表1 复合豆浆酒的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of compound soym ilk liquor

1.3.4 复合豆浆酒发酵工艺条件优化单因素试验

以黄豆浆为基准，依次考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、绿豆浆添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、酿酒酵母接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及发酵时间（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）对复合豆浆酒感官评分的影响，以确定较佳的白砂糖添加量、绿豆浆添加量、酿酒酵母接种量、发酵时间。

1.3.5 复合豆浆酒发酵工艺条件优化响应面试验

在单因素试验的基础上，选取白砂糖添加量（A）、绿豆浆添加量（B）、酿酒酵母接种量（C）、发酵时间（D）为考察因素，以感官评分（Y）为评价指标，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[23]，进行4因素3水平的响应面分析试验，确定复合豆浆酒最佳的发酵工艺条件，因素与水平见表2。

表2 复合豆浆酒发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optim ization of compound soym ilk liquor

1.3.6 数据分析处理方法

以上每个试验重复3次，结果取平均值。采用OriginPro 10.1软件进行数据制图和统计分析。采用Design Expert 11.1.0.1软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 复合豆浆酒发酵工艺条件优化单因素试验结果

2.1.1 白砂糖添加量对复合豆浆酒感官评分的影响

控制处理条件为绿豆浆添加量15%、酿酒酵母接种量0.3%、发酵时间6 d，考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）对复合豆浆酒感官评分的影响，结果见图1。

图1 白砂糖添加量对复合豆浆酒感官评分的影响Fig.1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由图1可知，当复合豆浆酒中白砂糖添加量从6%增至10%时，复合豆浆酒的感官评分也随之增加；当添加量达到10%时，复合豆浆酒的感官评分达到最高分，为（83.3±0.7）分。但随着白砂糖添加量的继续增加，复合豆浆酒的感官评分开始呈现下降的趋势。糖分在复合豆浆酒发酵过程中主要转化为乙醇，也可以转化成酸类、酯类、醛类等物质[8]，复合豆浆酒在发酵过程中，可发酵性糖过少会出现酒体不丰满、香味不足的现象，可发酵性糖过多则会造成酒体酸度偏大等不良现象。故选用白砂糖添加量为8%、10%及12%用于后续响应面优化试验。

2.1.2 绿豆浆添加量对复合豆浆酒感官评分的影响

控制处理条件为白砂糖添加量10%、酿酒酵母接种量0.3%、发酵时间6 d，考察绿豆浆添加量（5%、10%、15%、20%、25%）对复合豆浆酒感官评分的影响，结果见图2。

图2 绿豆浆添加量对复合豆浆酒感官评分的影响Fig.2 Effect ofmung bean m ilk addition on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由图2可知，绿豆浆的添加能显著改善豆浆酒的风味特征（P＜0.05），不仅能减弱豆浆酒中的豆腥味，而且能使其香气更加丰满。复合豆浆酒的感官评分随着绿豆浆添加量的增加而呈现出先增高后降低的趋势，当绿豆浆添加量为20%时，复合豆浆酒的感官评分达到最高，为（85.6±1.0）分。因绿豆溶出物含量较黄豆低[20，24]，故绿豆浆添加量过大会导致复合豆浆酒呈现风味不够饱满的现象。因此，当绿豆浆添加量适当时才能赋予复合豆浆酒特殊的风味及口感。由此选择15%、20%、25%的绿豆浆添加量进行响应面优化试验。

2.1.3 酿酒酵母接种量对复合豆浆酒感官评分的影响

控制处理条件为白砂糖添加量10%、绿豆浆添加量20%、发酵时间6 d，考察酿酒酵母接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对复合豆浆酒感官评分的影响，结果见图3。

图3 酿酒酵母接种量对复合豆浆酒感官评分的影响Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由图3可知，当酿酒酵母接种量小于0.4%时，复合豆浆酒的感官评分随着酿酒酵母接种量的不断增加而增加。当酿酒酵母接种量为0.4%时，复合豆浆酒的感官评分达到最高，为（86.1±0.5）分。酿酒酵母在发酵过程中能将可发酵性糖转化为二氧化碳和乙醇，同时还会产生一些醇、醛、酸、酯等香味物质[1，12]。当酿酒酵母接种量较低时，容易使酿酒原料不完全发酵，造成复合豆浆酒的酒精度偏低、酒香不突出等现象。当酿酒酵母的接种量为0.3%～0.5%时，复合豆浆酒的感官评分虽有变化，但相互之间并无显著性差异（P＞0.05），表明酿酒酵母接种量从0.3%继续增加后对复合豆浆酒的感官特性并无显著性影响。所以选择酿酒酵母接种量为0.2%、0.3%、0.4%进行响应面优化试验。

2.1.4 发酵时间对复合豆浆酒感官评分的影响

控制处理条件为白砂糖添加量10%、绿豆浆添加量20%、酿酒酵母接种量0.3%，考察发酵时间（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）对复合豆浆酒感官评分的影响结果见图4。

图4 发酵时间对复合豆浆酒感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由图4可知，当复合豆浆酒的发酵时间为7 d时，复合豆浆酒的感官评分最高，为（87.9±0.7）分。当发酵时间少于7 d时，因发酵醪液中可发酵性糖类还未完全被酿酒酵母所利用，酒体略显寡淡，香味浓郁程度不高。当发酵时间超过7 d后，复合豆浆酒的酸度开始增大，破坏了酒体的风味。其原因可能是当发酵时间过长时，酒精抑制了酿酒酵母的生长，出现了菌体自溶现象，同时一部分乙醇被转化为有机酸，导致酒体酸度增加[25]。因此，选择发酵时间为6～8 d进行响应面优化试验。

2.2 复合豆浆酒发酵工艺条件优化响应面试验结果

在单因素试验的基础上，以复合豆浆酒的感官评分（Y）为响应指标，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，通过Design Expert11.1.0.1软件设计响应面法试验，考察白砂糖添加量（A）、绿豆浆添加量（B）、酿酒酵母接种量（C）、发酵时间（D）4个因素对复合豆浆酒感官评分的影响，响应面试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

经Design Expert软件对表3的数据进行多元回归拟合，得到复合豆浆酒感官评分的回归方程：

表3 复合豆浆酒发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optim ization of compound soym ilk liquor

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

续表

由表4可知，由Box-Benhnken中心组合试验设计原理所得的回归模型极为显著（P＜0.01），且失拟项检验不显著（P＞0.05），表明未知因素对试验结果的干扰较小，该试验模型能充分拟合试验数据，并可以用于确定复合豆浆酒酿造的最佳工艺[26-27]。4个因素对复合豆浆酒感官评分影响的主次顺序依次为D＞A＞C＞B，即发酵时间＞白砂糖添加量＞酿酒酵母接种量＞绿豆浆添加量，其中一次项A、D和交互项CD对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AB对结果影响显著（P＜0.05）；二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），D2对结果影响显著（P＜0.05）；其他项则对结果影响不显著（P＞0.05）。根据复合豆浆酒感官评分回归方程得出不同因子的响应面分析图，结果见图5。

图5 各因素交互作用对复合豆浆酒感官评分的响应面曲线及等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

响应面图曲面坡度越陡峭及对应的等高线越密集呈椭圆形表示两因素交互影响越大[27-30]。由图5可知，因素C与因素D之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭，等高线也最为密集，即因素C与因素D之间具有最强的交互作用；因素A与因素B之间所形成的响应面曲面坡度陡峭程度较CD次之。该结果与表4方差分析所得的酿酒酵母接种量与发酵时间之间具有极显著的交互作用（P＜0.01）、白砂糖添加量与绿豆浆添加量之间具有显著的交互作用（P＜0.05）的结论相吻合。

通过Design Expert软件分析确定复合豆浆酒的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量10.82%、绿豆浆添加量19.06%、酿酒酵母接种量0.27%及发酵时间6.22 d，在此优化条件下，复合豆浆酒感官评分的理论值为91.17分。为便于实际操作，将复合豆浆酒的最佳发酵工艺条件修订为白砂糖添加量10.8%、绿豆浆添加量19%、接种量0.27%及发酵时间6.2 d，在此最优发酵工艺条件下，进行3次平行验证，得到复合豆浆酒的感官评分为（91.4±0.8）分，与其理论值基本一致。

2.3 理化指标分析

在最佳发酵工艺条件下得到的复合豆浆酒其总糖含量为12.1g/L、酒精度为4.3%vol、总酸含量为7.2g/L、氨基酸态氮含量为0.24 g/L。以上4种理化指标均符合国标GB/T 23546—2009《奶酒》[22]的标准。

3 结论

在单因素试验的基础上采用响应面法对复合豆浆酒的发酵工艺条件进行了优化，确定其最优发酵工艺条件：在黄豆浆中添加19.1%的绿豆浆、10.8%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，利用柠檬酸盐缓冲液调节pH为6.5，搅拌至白砂糖完全溶解，加热至60℃，采用乳化均质机（压力为15MPa）均质，均质后在95℃条件下加热杀菌5min；待样品冷却后，在无菌条件下接入0.27%经活化后的酿酒酵母菌悬液，25℃条件下发酵6.2 d后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此条件下可获得色泽微黄透明、豆香与酒香和谐、酒体丰满圆润的复合豆浆酒，其感官评分为91.4分。