腹腔镜子宫腺肌瘤切除术后辅助治疗对种植期内膜HOXA10及其基因启动子甲基化的影响*

吴青，杨云玲，林燕玲，林坦

[1.浙江省人民医院（杭州医学院附属人民医院） 妇科，浙江 杭州 310014；2.福建省立医院（福建医科大学省立临床医学院） 妇产科，福建 福州 350001]

子宫腺肌瘤是有活性内膜侵入子宫肌层局限生长，伴周围肌层代偿性增生肥大，临床多以渐进性痛经、经量增多和不孕等就诊；可能影响子宫内膜容受性[1-2]，并且子宫腺肌病患者妊娠还容易发生早产、胎膜早破和妊娠期高血压等[3]。对有生育需求的患者，促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）是治疗子宫腺肌病的主要药物，但部分患者效果不佳，或停药后快速复发和进展。子宫腺肌病病灶切除术可快速去除病灶，亦有术后顺利妊娠分娩的病例[4]。术后联合GnRH-a及曼月乐可维持疗效，降低复发率，有利于术后长期管理。

HOX基因属于多基因家族的转录调节基因，其蛋白产物通过与DNA结合激活或抑制目的基因，调节胚胎发育，介导子宫内膜容受性的形成，已证实HOXA10基因对子宫内膜容受性和着床是必需的[5]。DNA甲基化是表观遗传学最主要的一种修饰方式，HOXA10基因是受DNA甲基化调控的基因之一，可能与子宫内膜异位症发病和不孕有关。2005年有研究[6]报道发现了HOXA10基因启动子的3个甲基化区域（F1、F2、F3），且盆腔子宫内膜异位症影响HOXA10基因甲基化，进而降低子宫内膜HOXA10基因表达。后续研究[7]提示，在HOXA10基因启动子的3个甲基化区域中，F1片段与HOXA10基因的转录调控最密切。

目前，对子宫腺肌病内膜HOXA10基因表达情况及其甲基化水平知之甚少。本研究从子宫内膜容受性角度，分析腹腔镜子宫腺肌瘤切除术后联合GnRH-a和曼月乐综合治疗的效果，及其对种植窗期子宫内膜HOXA10-mRNA水平的影响和基因启动子F1甲基化程度，探讨子宫腺肌病对内膜容受性的影响机制，研究改善子宫腺肌瘤患者子宫内膜容受性的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年6月－2016年6月就诊于福建省立医院妇科的子宫腺肌瘤77例作为观察组，年龄（40.5±2.3）岁。观察组月经过多和痛经的患者45例，仅月经过多者17例，仅痛经者15例，CA125为（109.0±62.3）u/ml。同期因卵巢畸胎瘤、输卵管系膜囊肿就诊的月经规则、已生育患者24例作为对照组，平均年龄（39.9±3.3）岁。两组患者年龄无明显差异（P=0.457）。

观察组所有患者均有渐进性痛经和/或月经增多表现；CA125升高；彩超提示子宫肌层回声不均、子宫腺肌瘤（肌壁间）≥4 cm；且术后均经过病理检查结果证实；排除有严重感染、心血管疾病和妇科其他疾病的患者，排除手术禁忌的患者。本研究通过医院伦理委员会审核通过，所有患者均知情同意，愿意参与本试验。

1.2 方法

1.2.1 观察组观察组患者均采用尿促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）排卵试条（润和生物医药科技有限公司）监测排卵，于阳性后第7天黄体中期使用一次性宫腔组织吸引管（上海家宝医学保健科技有限公司）收集子宫内膜，并行腹腔镜子宫腺肌瘤切除术，术后所有患者均皮下注射诺雷得（醋酸戈舍瑞林缓释剂，Astra Zeneca）3.6 mg，连续治疗6个月后，宫内放置曼月乐（左炔诺孕酮宫内缓释系统，LNGIUS）。患者因有生育要求或点滴阴道出血不愿继续放置，12个月后取出曼月乐，取出曼月乐后同法监测排卵并收集子宫内膜。

1.2.2 对照组采用尿LH排卵试条监测排卵，于阳性后第7天收集子宫内膜，并行腹腔镜卵巢畸胎瘤剥除术。

1.3 子宫内膜HOXA10-mRNA水平的检测

液氮中取出的子宫内膜进行RNA抽提及逆转录，采用RNA抽提及逆转录试剂盒（Invitrogen，USA），并且检测RNA的完整性及纯度。构建荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）体系 25.0μl，含 2×Power SYBR®Green PCR Master Mix 12.5μl、上游引物 F（10 pmol/μl）0.5μl、下游引物 R（10 pmol/μl）0.5μl、cDNA 模板 2.0μl、ddH2O 9.5μl。HOXA10反应条件为：95℃ 15 min，95℃10 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环，72℃总共延伸10 min。阴性对照扩增体系以三蒸水代替多聚酶，以β-actin基因作为内参照，分析各反应的荧光强度，得出反应的CT值，并绘制β-actin基因的标准曲线，参照标准曲线，得出目的基因的相对反应起始拷贝数。目的mRNA=目的基因的拷贝数/内参照的拷贝数。

1.4 DNA提取与亚硫酸氢盐修饰

按照说明书操作，提取DNA（天根公司，美国），紫外分光光度计定量。基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后，序列中未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，发生甲基化的胞嘧啶则无改变。取20.0μl DNA用于亚硫酸氢盐（天根公司，美国处理）处理，并置于-80℃保存。

1.5 亚硫酸氢盐修饰后测序

亚硫酸氢盐修饰后测序（bisulfite sequencing PCR，BSP）引物见附表。由上海生工生物工程设计与合成：检测HOXA10基因启动子3个片段中F1的甲基化产物，片段大小均为261 bp，共确定有19个CpG位点，观察组共检测1 463个CpG位点。BSP检测体系（50.0μl）：Buffer 5.0μl，dNTP 4.0μl，Taq 0.5μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，模板8.0μl，ddH2O 30.5μl，反应条件 ：94℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 10 min，4℃保存。每个样本的PCR产物克隆至pMD19-T-simple载体（参见Takara说明书），送北京阅微基因技术有限公司测序。

附表 HOXA10-mRNA和亚硫酸氢盐修饰后HOXA10启动子测序的引物Attached table HOXA10-mRNA and bisulfite-modified primers for sequencing HOXA10 promoter

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0软件（SPSS公司，芝加哥，IL，美国）进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态资料组间数据比较采用t检验；计数资料采用百分比（%）表示，两样本率的比较采用 χ2检验（n＞40）和 Fisher's确切概率法（n＜40），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

术后18个月随访均诉综合治疗效果满意，痛经、月经过多明显改善。对照组和观察组术前子宫内膜HOXA10-mRNA分别为（0.9±0.4）和（0.5±0.1），差异有统计学意义（t=9.26，P=0.000）。观察组术后18个月子宫内膜HOXA10-mRNA为（0.9±0.3），与术前相比明显升高，差异有统计学意义（t=11.01，P=0.000）。

对照组和观察组患者术前子宫内膜HOXA10启动子F1片段甲基化位点数分别为（2.2±1.8）和（6.5±3.7）；观察组明显高于对照组，差异有统计学意义（t=5.63，P=0.000）。观察组术后18个月子宫内膜HOXA10启动子F1片段甲基化位点数为（2.8±2.0），与术前相比明显下降，差异有统计学意义（t=5.81，P=0.000）。观察组术前有34.0%（498/1463）的CpG位点可检测到甲基化改变，明显高于手术及综合治疗后（9.7%，142/1463），两组甲基化率比较，差异有统计学意义（χ2=253.50，P=0.000）。

3 讨论

3.1 子宫腺肌病对生育以及子宫内膜容受性的不良影响

子宫腺肌病是雌激素依赖性疾病，有活性的子宫内膜侵入肌层后浸润性生长，可能与子宫内膜-肌层连接带屏障的破坏有关，也与免疫因素有关[8]。子宫腺肌病可以影响精子运输、胚胎植入和宫内环境等多个环节，从而影响生育功能。子宫内膜-肌层连接带是一个功能单位，与精子运输、胚胎着床、胎盘发育和月经有关，其破坏可导致腺肌病的发生和发展[9-10]。

TREMELLAN等[11]研究报道，严重子宫腺肌病内膜巨噬细胞密度明显高于正常人群，可影响胚胎着床。对于接受体外受精联合胚胎移植术（in vitro fertilisation，IVF）的妇女，子宫腺肌病患者临床妊娠率（24/98，24.5%）明显低于正常妇女（245/567，43.2%）[12]。HOXA10作为子宫内膜容受性的经典标志分子，子宫腺肌病患者分泌期HOXA10基因表达明显降低，提示腺肌瘤影响子宫内膜容受性[13]。

3.2 子宫腺肌瘤病灶切除联合GnRH-a和曼月乐可改善内膜容受性

子宫腺肌瘤切除术直接去除子宫肌层异位病灶，改善患者临床症状，保留生育功能，减少腺肌病对盆腔、子宫局部环境的不良影响，术后联合长效GnRH-a，可抑制残余异位病灶生长和复发。长效GnRH-a治疗可抑制腹腔液活化的巨噬细胞，降低白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，减少炎性因子对卵子、胚胎的不良影响[14]；还可增加内膜细胞黏附分子如整合素αVβ3的表达，改善子宫内膜容受性[15]。曼月乐含强效孕激素，高效作用于子宫肌层，并进一步使在位内膜、肌层异位病灶萎缩，有利于控制腺肌病的发展。

前瞻性对照研究[16]报道，165例子宫腺肌病患者接受保守性手术联合6个月GnRH-a或单纯保守性手术，术后随访2年妊娠率达69.0%。本研究显示，观察组术后联合GnRH-a和曼月乐患者HOXA10-mRNA的水平明显高于术前。因此，子宫腺肌瘤病灶切除联合长效GnRH-a和曼月乐，可改善内膜容受性。

3.3 子宫腺肌瘤与子宫内膜HOXA10启动子甲基化

DNA甲基化是人类基因组最为常见的一种表观遗传学事件，主要发生在CpG二核苷酸胞嘧啶的5’-碳原子，在肿瘤发生机制中有重要意义。一般抑癌基因的启动子区5’CpG岛处于非甲基化状态，CpG岛高甲基化可以使抑癌基因失活、转录抑制，导致其表达下降，最终促使肿瘤的发生[17]。2005年WU等[6]报道发现了HOXA10基因启动子的3个甲基化区域，且子宫内膜异位症影响HOXA10基因甲基化，进而降低子宫内膜HOXA10基因表达。HOXA10是子宫内膜容受性的经典标志分子，与胚胎着床密切相关，其基因启动子甲基化水平异常，将影响HOXA10的表达。本研究显示，术后联合GnRH-a和曼月乐治疗的患者，HOXA10启动子甲基化率明显低于术前，提示方案可有效降低其甲基化水平，进而调控HOXA10的表达，影响子宫内膜容受性。

本研究着眼于子宫内膜容受性的研究，提示子宫腺肌瘤会对着床期子宫内膜HOXA10产生不利影响，腹腔镜子宫腺肌瘤切除术后联合GnRH-a和曼月乐综合治疗，可提高种植窗期子宫内膜HOXA10-mRNA水平，改善子宫内膜容受性，其机制可能是通过降低HOXA10基因启动子区甲基化水平。但以上仅是在体实验研究，GnRH-a和局部高效孕激素对子宫腺肌病在位内膜的微观改变及作用机制，仍待体外实验进一步验证及深入探索。