小鼠膀胱癌正位模型的建立及纳米载药体系研究

于肖肖，李丹丹，高基民

(温州医科大学检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035)

膀胱癌是全世界第9种常见的恶性肿瘤，也是第13种最常见的癌症死亡原因[1-2]。监测膀胱癌治疗效果需要合适的动物模型，传统的监测技术需要将动物处死，而近十几年来得到快速发展的小动物活体成像技术解决了这个问题。生物发光成像技术(BLI)是一种非侵入性的实时可视化成像模型，可以在细胞、分子或基因水平上检测生物体内的生理或病理变化[3]。纳米载药体系近几年来发展迅速，纳米材料可以包载小分子物质靶向运送至肿瘤部位，提高治疗效果[4-5]。本研究构建了稳定表达荧光素酶的膀胱癌细胞MB49细胞系，构建了小鼠膀胱癌皮下模型，用明胶包裹的单壁碳纳米管作为纳米载药体系，包载鼠粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)和阿霉素(DOX)，通过小鼠眼眶静脉进行治疗，同时对小鼠进行近红外光照射治疗，以期达到光热、免疫、化疗联合治疗的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

MB49细胞是小鼠膀胱癌细胞株，购自中国科学院。

1.1.2 试剂

1640培养基、胎牛血清、嘌呤霉素，美国Gibco公司；青霉素、链霉素溶液，中国碧云天公司。

1.1.3 试验动物

C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠购自上海斯莱克动物中心，雌性，6～8周龄，饲养于温州医科大学SPF级实验室，独立送风柜中饲养，自由饮水和进食。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒的构建

选择实验室保存的质粒PcDNA3.1-FLAG-Luc2GFP为模板，设计PCR引物(F：5-CGAGAC TAGTTCTAGGCCACCATGGAAGATGC-3，R：5-TTG CGGCCGTCTAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3)，由上海桑尼公司合成。PCR反应体系为25 μL，反应条件为：98 ℃变性10 s；60 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.5 min，共30个循环。通过胶回收得到Luc2GFP片段，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对载体质粒pLVX-EF1a-IRES-Puro进行酶切，得到线性的质粒pLVX-EF1a-IRES-Puro，和Luc2GFP进行无缝克隆，用trans 5ɑ进行转化，提取质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定，取鉴定符合预期的克隆进行测序。

1.2.2 稳定表达荧光素酶的膀胱癌MB49-Luc细胞的构建

利用实验室的慢病毒包装平台，对pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒进行包装，得到慢病毒，利用慢病毒感染MB49细胞，用2 μg·mL-1嘌呤霉素进行筛选，通过流式细胞术单细胞分选技术得到单个MB49-Luc细胞，扩增培养，通过流式细胞术和免疫印迹来筛选出能够表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的细胞，用于后续动物试验。

1.2.3 小鼠膀胱癌正位模型的构建

BALB/C雌性裸鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠150 μL，待小鼠呼吸平稳后，将小鼠放于无菌纸垫料上，用酒精棉球对小鼠外尿道口处进行消毒。将液体石蜡中浸泡过的一次性静脉留置针软管沿着小鼠尿道外口插入膀胱，用PBS冲洗3次，注入100 μL配制好的0.1 mol·L-1HCl，待留置20 s后，吸出50 μL弃掉，迅速注入50 μL 0.1 mol·L-1NaOH并留置5 s，然后全部吸出，用PBS冲洗3次，排空膀胱，注入100 μL 0.2×106MB49-Luc细胞，然后留置于膀胱2 h。

1.2.4 纳米载药体系治疗小鼠

将6～8周龄C57BL/6雌性裸鼠皮下注射2×106MB49-Luc细胞，7 d后小鼠皮下成瘤。将小鼠分为4组，每组5只，分别为PBS组、Gel@SWCNTs-DOX组、Gel@SWCNTs-GMCSF组、Gel@SWCNTs-DOX-GMCSF组。对小鼠肿瘤内注射100 μL治疗材料，30 min后NIR(1 W·cm-2)照射肿瘤2 min治疗，4 d后活体成像监测肿瘤治疗效果。

2 结果与分析

2.1 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒的构建

以质粒PcDNA3.1-FLAG-Luc2GFP为模板，PCR扩增出Luc2GFP片段(图1)。

图1 Luc2GFP基因凝胶电泳的结果

将载体质粒pLVX-EF1a-IRES-Puro用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切后，切胶回收，与PCR得到的Luc2GFP基因片段进行无缝克隆。将连接后的产物转化入trans 5ɑ，提取质粒，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ进行酶切鉴定，得到2个大小为8.9 ku和2.4 ku的片段，说明成功构建了pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒(图2)。

图2 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒酶切的结果

2.2 稳定表达荧光素酶的膀胱癌MB49-Luc细胞的构建

利用流式细胞术检测到MB49-Luc细胞中Luc和GFP的表达达到93.8(图3)。Western blot检测发现，重组细胞中Luc和GFP均有表达(图4)。

图3 流式细胞仪检测的结果

图4 Western blot检测的结果

2.3 小鼠膀胱癌正位模型的构建

通过留置针将MB49-Luc细胞注入6～8周的BALB/C雌性裸鼠膀胱内，分别在第11天和第20天观察，结果显示，小鼠膀胱癌正位模型构建成功(图5)。

图5 小鼠膀胱癌正位模型的活体成像

2.4 纳米载药体系对小鼠的治疗效果

如图6所示，与对照组PBS相比，各处理对小鼠肿瘤均有一定的治疗效果。

图6 不同处理组小鼠肿瘤的生长情况

3 讨论

纳米材料种类繁多，如脂质体、碳纳米管、聚合物纳米粒子、聚合物胶束、固体脂质纳米粒、囊泡、树枝状聚合物及硅、金、银等金属纳米粒子[6]。纳米载体的粒径一般为1～1 000 nm[7]，其中单臂碳纳米管因其自身的特性被广泛关注[8-9]，同时也有高度疏水性和细胞毒性等缺点[10-11]，实际使用中可利用明胶来修饰单臂碳纳米管，降低其疏水性和细胞毒性[12-13]。

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是具有二硫键的酸性糖蛋白[14]，可以刺激产生大量造血和非造血细胞，激活和引发髓样细胞群产生炎症介质，具有促炎细胞因子的作用[15-17]。阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种蒽环类化合物，用于治疗血液恶性肿瘤、软组织肉瘤等多种癌症，且对实体瘤具有显著活性[18]。利用明胶修饰的单臂碳纳米管来包载GM-CSF，DOX对小鼠膀胱癌进行治疗，同时利用近红外光进行光热治疗，促进纳米载药体系包载物质的释放，提高肿瘤部位药物浓度，并利用活体成像对治疗效果进行纵向监测，结果显示，纳米载药体系对小鼠膀胱癌有一定的治疗效果，为后续膀胱癌的治疗研究提供参考。