西瓜炭疽病菌离体叶片接种鉴定技术

孙玉燕，范敏，何艳军

(浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

西瓜(Citrulluslanatus)隶属葫芦科西瓜属植物，我国目前西瓜的年栽培面积约为187万hm2，总产量约为7 900万t，居世界首位，其中浙江省西瓜年栽培面积约为7万hm2，总产量约为215万t[1]。西瓜炭疽病(Colletotrichumlagenerium)是由瓜类炭疽病菌引起的一种世界性病害，在保护地及露地栽培中均可发病，特别是在湿度较大的南方地区发病尤重，造成西瓜大量减产，甚至绝收。西瓜炭疽病在全生育期均可发病，叶片染病后，初为圆形或不规则形水渍状斑点，后变褐色，出现同心轮纹；茎蔓染病，初始出现水渍状黄褐色圆形或长椭圆形凹陷病斑，后变黑褐色，严重时导致茎蔓枯死；果实染病表现为水浸状凹陷形褐色圆斑或长圆形斑，湿度大时病斑上产生粉红色黏状物[2-3]。目前防治西瓜炭疽病的主要方法包括选用抗病品种、对种子进行温汤浸种或药剂拌种、轮作、加强田间管理、控温湿度、药剂防治等措施，其中选育具有炭疽病抗性的西瓜品种是解决西瓜炭疽病的根本途径。

西瓜抗病性鉴定筛选评价工作是抗病育种的重要环节。目前，西瓜炭疽病的抗性鉴定及评价方法有以下2种。1)苗期喷雾接种及分级评价法。将炭疽病菌配成孢子浓度为1×106的悬液，喷雾法接种于二叶期的无菌苗上，置于24～26 ℃、相对湿度95%～100%的黑暗条件下保湿48 h后给予正常光照，7～10 d后观察发病情况[4-5]。参考刘莉等[6]的方法将西瓜幼苗对炭疽病的抗性分为0、1、3、5、7、9等6个等级。2)离体叶接种和AD评价法。配置孢子浓度为1×106的菌液，利用注射器悬滴接种叶龄为15～20 d的离体叶片，接种后第6天调查发病情况。抗病鉴定利用平均病斑直径和病情指数进行评价[7]。此外，西瓜炭疽病的接种方法还包括涂抹法及点滴法[6]。

本研究利用点滴法对西瓜离体叶片进行炭疽病接种鉴定，并利用病斑直径及发病率对西瓜种质材料进行抗病性鉴定评价。与活体接种鉴定相比，离体叶片接种鉴定具有不损伤植株、节省菌液、接种标准一致、不产生病原菌扩散等优点，可为西瓜炭疽病的抗性鉴定及筛选评价提供新的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用病菌为长岭西瓜炭疽病菌，由浙江大学生物技术研究所宋凤鸣教授团队提供。接种材料为浙江省农科院蔬菜所西瓜研究室提供的12份西瓜种质材料，分别为Charleston Gray、Navajo Sweet、PI288317、PI279460、PI368509、PI536457、PI278038、Sun sweet、Ford hook、郑州2号、冬瓜皮、庆久。将这些材料的种子在55 ℃温水浸种后，在室温下浸泡3～4 h，用湿润毛巾包裹好，放入28 ℃恒温箱中催芽36 h，待种子萌芽后播入育苗穴盘中，育苗基质由草炭和蛭石按3∶1的比例配置而成。每份材料9株，待第4片真叶完全展开时准备进行接种。

1.2 炭疽病菌培养取样及离体叶片处理

PDA液体培养基配置。200 g新鲜马铃薯去皮后切成小块，煮沸30 min，2层纱布过滤去除残余，在滤液中加入20 g葡萄糖，蒸馏水定容至1 000 mL，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

炭疽病菌培养。将保存的长岭西瓜炭疽病菌转接到PDA液体培养基中，将其在温度为28 ℃、转速为200 rpm的摇床上避光摇3 d，使其产生大量的孢子，将含孢子的PDA液体培养基用2层无菌纱布过滤，除去菌丝以获取孢子悬浮液，利用血球计数板在显微镜下将孢子悬浮液的浓度调整为1×106mL-1，用于接种鉴定。

离体叶片处理。利用剪刀剪取植株第4片完全展开的真叶，以75%酒精表面消毒后，用无菌水冲洗，用吸水纸吸干表面水分，切口用封口膜封好，备用。

1.3 炭疽病菌接种离体叶片

在透明塑料盒底层放入吸水纸，并加入无菌水使其湿润，将准备好的离体叶片置于吸水纸上。用微量移液器在叶片表面点滴10 μL长岭西瓜炭疽病菌孢子悬浮液，每个叶片根据不同大小接种3～5个点(图1)，并用透明塑料盖子密封。将塑料盒放在25 ℃、湿度90%的培养箱中，暗处理48 h后给予正常光照，选择无菌PDA接种为对照，每份种质处理9个叶片，5 d后调查发病情况。

图1 点滴法对西瓜离体叶片接种长岭西瓜炭疽病菌

1.4 数据统计及分析

抗性鉴定指标有平均病斑直径及发病率。病害调查时，用电子游标卡尺测量每个接种点病斑的最大长度和最大宽度，记作纵径和横径。病斑直径为所有接种点病斑横径和纵径的平均值。根据病斑直径[7]对材料的炭疽病抗性进行划分：0 mm，免疫；<0.50 mm，高抗；0.51～1.50 mm，抗病；1.51～2.00 mm，中抗；2.01～3.00 mm，感病；>3.01 mm，高感。

另外调查叶片发病率，即发病点占总接种点的百分比。用SAS和Excel软件对抗性鉴定的指标即平均病斑直径和发病率数据进行整理统计。

2 结果与分析

2.1 长岭西瓜炭疽病菌观察及发病症状表现

将长岭西瓜炭疽病菌接种到PDA固体培养基中，生长至第10天，菌落颜色由中心至边缘变为深灰色，边缘波状，出现同心轮纹。显微镜下显示分生孢子为无色，单孢为卵圆或长圆形，具有隔膜。西瓜叶片接种长岭西瓜炭疽病菌后，出现长椭圆形或不规则形的褐色同心轮纹(图2)。

图2 长岭西瓜炭疽病菌的菌落表型、孢子形态及发病症状

2.2 西瓜种质抗病性鉴定

采用点滴法对西瓜离体叶片进行炭疽病菌接种，5 d后调查发病结果。
图3显示，不同种质材料对长岭西瓜炭疽病菌的抗性表现不同，有的种质材料对长岭西瓜炭疽病菌表现为免疫，而有的材料在长岭西瓜炭疽病菌侵染后整个叶片出现病斑。

图3 点滴法筛选获得不同抗性的西瓜种质材料

利用平均病斑直径及发病率[7]对12份西瓜种质的炭疽病抗性进行评价(表1)。这12份西瓜种质材料的平均病斑直径为0～13.79 mm，发病率为0～88.00%，抗性存在较大差异。其中获得对长岭西瓜炭疽病菌免疫的材料1份(PI368509)，病斑直径为0 mm，发病率为0；抗病材料1份(PI278038)，病斑直径为0.71 mm，发病率为17.50%；中抗材料1份(Sun sweet)，病斑直径为1.94 mm，发病率为25.00%。此外，对长岭西瓜炭疽病菌表现为感病的材料1份(郑州2号)，病斑直径为2.07 mm，发病率为18.18%；对长岭西瓜炭疽病菌表现为高感的种质材料为8份，包括Charleston Gray、Navajo Sweet、PI288317、PI279460、PI536457、Ford hook、冬瓜皮、庆久，病斑面积为3.88～13.79 mm，发病率为30.33%～88.00%。

表1 离体叶片接种长岭西瓜炭疽病抗性鉴定结果

此外，对平均病斑直径及发病率的相关性进行分析发现，二者相关系数达0.88，说明平均病斑直径与发病率为显著正相关。上述结果表明，结合点滴法进行离体叶片鉴定技术及利用平均病斑直径和发病率的抗性评价体系，可以筛选出抗性不同的种质材料，为西瓜炭疽病的抗性遗传改良奠定基础。

3 小结与讨论

浙江省处于亚热带地区，常年高温、多雨、湿度较大，极易导致西瓜炭疽病的暴发与流行。目前生产上防治西瓜炭疽病主要依赖药剂防治，对西瓜的质量安全及生态环境安全影响较大，同时也导致病原菌产生抗药性，造成药剂过量的恶性循环。因此，筛选抗病材料、选育抗病品种是目前西瓜炭疽病生产上亟待解决的问题。

建立可靠的人工接种方法是西瓜炭疽病抗性鉴定与评价的前提。目前，针对西瓜炭疽病的接种及评价方法主要有活体植株喷雾鉴定及分级评价法[4、6]、离体叶片接种鉴定及AD评价法[7]。本研究取西瓜植株完全展开的第四片真叶，配置孢子浓度为1×106mL-1的悬浮液，利用微量移液器在每个接种点接种10 μL的长岭西瓜炭疽病菌孢子液，每个叶片根据大小接种3～5个点，在温度 25 ℃，湿度为90%的光照培养箱中保持黑暗48 h后给予正常的光照，5 d后调查发病情况，利用平均病斑直径及发病率进行鉴定评价，可以较好的区分不同西瓜种质材料对长岭西瓜炭疽病的抗性表现。利用该接种方法，共筛选获得西瓜炭疽病免疫材料1份(PI368509)、抗病材料1份(PI278038)、中抗材料1份(Sun sweet)(表1)，可为选育抗病、优质的西瓜品种提供材料基础。

相比活体喷雾法[4、6]，本研究方法具有不损伤植株、节省菌液、不会产生病原菌扩散的优点；与文生仓等[7]所报道的利用微量注射器的悬滴法相比，该研究方法具有接种标准一致(即每个接种点接种10 μL的孢子悬浮液)，可定量进行鉴定评价的优点。此外，本研究对平均病斑直径和发病率进行相关性分析，发现两者的相关系数达到0.88，呈显著正相关，说明利用平均病斑直径和发病率进行离体叶片抗性鉴定评价是可靠的。综上，西瓜离体接种鉴定方法(点滴法)可为西瓜炭疽病的抗性鉴定提供新的技术参考。