水稻根系性状和有机酸分泌对铊吸收能力的影响

刘 芳，杨钊楠，杨睿祺，王摸云，姚 焱，张 平

（1.植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室/广州大学生命科学学院，广东 广州 510006；2.广州大学化学化工学院，广东 广州 510006）

【研究意义】铊（Tl）是一种剧毒的重金属,随着矿冶工业释放入环境。土壤中铊离子活跃，比砷(As)、汞(Hg)等重金属更容易被农作物吸收和积累，也更容易对人体健康造成危害［1-2］。我国是一个富铊资源国家，《重金属污染综合防治“十二五”规划》也将铊列为重点防控的重金属污染物之一。水稻作为我国的主要粮食作物，其生产安全关系到国家的粮食安全，提高产量的同时对水稻重金属抗逆的研究受到较多关注［3-4］。我国是世界水稻种植大国，全国人口有近2/3以稻米为食。研究不同水稻品种根系形态及有机酸分泌能力与重金属铊吸收能力的关系，有助于筛选铊吸收能力低的水稻品种适应食品安全的需要，同时有助于深入了解植物根系对铊吸收的机制。

【前人研究进展】根系是水稻地上部分与地下部分物质交换和信息交流的重要枢纽，植物的根系首先是与外源重金属接触的部位，重金属通过根系的吸收进入根系细胞内。根是植物体与重金属结合的关键部位，也是最易受重金属毒性影响的部位，水稻苗期根系性状如总根体积、总根面积、总根长、分枝数的变化可以反映植物抗重金属胁迫的强度［5］。重金属胁迫导致根系细胞结构破坏、细胞核裂解、线粒体数目减少、细胞壁肿胀等结果，而植物根系会通过增加边缘细胞数目、提高细胞抗逆作用,维持较高水平的POD、CAT和SOD活性来对抗重金属胁迫毒, 通过改变上述自身形态来应对土壤中的重金属等非生物逆境胁迫［6-8］。

【本研究切入点】目前，关于铊胁迫与水稻根系性状的关系未见相关报道，但有研究表明不同的植物根系影响植物获得重金属耐受性状。作为植物和外界重金属接触的第一道屏障，植物的根系形状有可能影响到植物对重金属的吸收或是耐受。在重金属环境下植物分泌有机酸是一种重要的耐性机制。根系通过分泌低分子量有机酸改变根际微生物的环境，同时有机酸可以与重金属离子形成金属配位体复合物，转化为无毒或者毒性较小的螯合形态，降低重金属对植物体的危害［9］。植物根系分泌的有机酸，主要有柠檬酸、苹果酸、草酸等［10］。不同植物在不同重金属胁迫下有机酸分泌种类不同，如铅胁迫能够持续促进杨梅根系苹果酸的分泌［11-12］，在黑麦草应对Zn胁迫的研究中发现，根系分泌的草酸和酒石酸含量会随着重金属胁迫程度的增加而升高［13］；镉胁迫不同苋菜品种根系分泌有机酸以柠檬酸和苹果酸为主，分泌量均随供镉浓度增加而增加［14］。在根系分泌物中，有机酸通过对重金属的螯合作用的外部排斥机制来降低植株对重金属的吸收［15-16］，而重金属的浓度也会影响水稻根际pH和有机酸的分泌，其中草酸、苹果酸、柠檬酸含量的增加可以促进水稻对重金属的吸收［17］。本研究着重分析植物体的根系形状和有机酸分泌对重金属铊吸收的影响。【拟解决的关键问题】选取华南地区18个水稻品种，利用水培试验的方法，比较各品种间铊吸收量与根系长度、根系数量关系，以及与有机酸分泌量的关系，明确水稻根系对铊吸收的主要影响因素。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种18个，编号为V1～V18，均来自华南地区常规品种。

供试材料于2019年春季在广州大学生化楼实验室培养，18个水稻品种种子分格放入育苗盘中，加入双蒸水漫过种子，遮光放入恒温培养箱中。等种子露白后，使用镊子调整水稻种子位置，保证萌发出的根系穿过育苗盘的间隙向下生长。5 d后每升双蒸水中加入10 mL大量元素储备液（NH4NO3114.3 g/L、NaH2PO450.4 g/L、K2SO489.3 g/L、CaCl2110.8 g/L、MgSO4·7H20 410.8 g/L、MgSO4200 g/L），1.25 mL微量元素贮备液（MnCl2· 4H2O 1 500 mg/L、（NH4）6Mo7O24· 4H2O 74 mg/L、H3BO3934 mg/L、ZnSO4· 7H2O 35 mg/L、CuSO4· 5H2O 31 mg/L、FeCl3·6H2O (FeCl3) 7 700（4 621）mg/L、柠檬酸（水合物）11 900 mg/L）作为水稻受试材料的培养液。置于光照强度为350 μmol/m2·s，光照12 h/d，温度28（±2）℃的培养箱培养。

铊储备液（Tl+1 g/L）：称取1.303 g TlNO3，用少许去离子水溶解并加入硝酸维持酸性环境，转移至1 000 mL棕色容量瓶定容，备用。使用时，用双蒸水稀释重金属母液至所需浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 不同水稻品种重金属铊吸收量测定 2019年春于广州大学生化楼实验室，将12 d的幼苗浸泡在3.0 mmol/L Ca(NO3)2溶液（pH 6.0）中过夜后放入5 mg/L Tl+处理液中24 h。处理条件为光照强度350 μmol/m2·s，光照12 h/d，温度28（±2）℃。24 h后取出供试水稻材料，利用移液器取出3 mL培养液通过原子吸收分光光度计测定，记为处理后的培养液重金属浓度，计算不同品种水稻铊吸收量：

1.2.2 不同水稻品种根系性状测定 培养24 h后取出植株放入10 mL无菌水中，收集6 h根系分泌物后，分组放在育苗盆中，照相机拍下根系性状照片，利用imageJ统计测定根系长度、根系数量。

1.2.3 不同水稻品种根系有机酸分泌量测定 将处理24 h的水稻苗移至无菌水中收集6 h根系分泌液。将含有根分泌物的无菌水放入-80℃冰箱6 h后，再放入真空冷冻干燥机冷冻干燥至无水分残留，用1 mL K2HPO4缓冲液（0.01 mol/L，pH 2.75）溶解冷冻干燥后的残余物，并用针式滤膜（0.45 μm）过滤至高效液相色谱仪（LC-20A，岛津，日本）的进样瓶中，上机测定。样品测定采用外标法，以保留时间定性，峰面积定量。色谱条件为：色谱柱C18（150 mm×4.6 mm，d×5μm），流动相由0.01 mol/L K2HPO4缓冲液（pH 2.75）和甲醇（体积比97：3）组成，流速为0.6 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL，检测波长210 nm。

标准曲线制作及标准溶液配置：依据前期研究，水稻在铊胁迫下根系分泌单一有机酸-草酸［18］。故准确称取草酸100 mg，去离子水溶解定容至100 mL作为母液。将这些母液稀释成不同倍数的稀释液(4个梯度)分别上机测定, 每个样品3次重复, 测定其峰面积, 以平均峰面积(y)对浓度(x)作图, 绘制标准曲线。

每个水稻品种设置3次重复，每个重复10株苗。测定数据用SPSS软件进行统计分析及差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同水稻品种重金属铊吸收量比较

重金属铊胁迫处理24 h后，18个水稻品种单位植株鲜重铊吸收量可分为4个组，各组间吸收量存在差异，但组内无差异：最高吸收量的V1、V2品种，单位植株鲜重铊吸收量为112.01、107.79 mg/kg；较高吸收量的V3～V7品种，铊吸收量为78.47～94.68 mg/kg；中等吸收量的V8～V12品种，铊吸收量为64.06～73.22 mg/kg；较低吸收量的V13～V18品种，铊吸收量为 55.29～63.81 mg/kg，铊吸收量最高的V1品种是最低品种V18的2倍（图1）。

图1 铊胁迫下不同水稻品种的吸收差异Fig.1 Absorption differences of different rice varieties under Tl treatment

2.2 不同水稻品种根系性状与铊吸收量的关系

为了分析水稻根系性状与吸收量的关系，测量了18个品种水稻根系总长度和根系数量，并建立了18个品种铊吸收量与根总长、铊吸收量与根数的相关性（图2）。如图2A所示，根系总长度与铊吸收量线性相关方程为y=-0.0099x +75.767，相关系数r=-0.014，根系长度与铊吸收量相关性极低。如图2B所示，根系数量与铊吸收量线性相关方程为y=-0.0889x + 81.187，相关系数r=-0.135，表明根系数量与铊吸收量相关性也很低。

图2 根系性状与铊吸收量的相关性Fig.2 Correlation between root traits and thallium absorption

2.3 不同水稻品种有机酸分泌量比较

进一步研究不同铊吸收量的水稻品种根系外泌有机酸量与铊吸收量的关系。选取两个高吸收量品种V1和V2、两个中等吸收量品种V6和V7、两个低吸收量品种V13和V15测定根系外泌有机酸量。如图3所示，6个品种草酸分泌量在1.46～ 2.11 mg/g 范围内，其中V2品种草酸分泌量最低，为1.46 mg/g，V15品种草酸分泌量最高，为2.11 mg/g。V2品种草酸分泌量显著低于V13、V15品种草酸分泌量。

图3 不同水稻品种草酸分泌量Fig.3 Oxalate secretion of different rice varieties

2.4 有机酸分泌量与铊吸收量的关系

6个品种铊吸收量与有机酸分泌量的关系如图4所示，线性回归方程为y=-0.0101x + 2.6295，相关系数r=-0.931（P＜0.01），说明铊吸收量与有机酸分泌量呈极显著负相关。

图4 不同水稻品种草酸分泌量与铊吸收量的相关性Fig.4 Correlation between oxalate secretion and thallium absorption in different rice varieties

3 讨论

重金属胁迫导致根系细胞结构破坏，细胞凋亡等结果，而植物根系会通过增加边缘细胞数目、提高细胞抗逆作用来对抗重金属胁迫, 水稻苗期根系性状如总根体积、总根面积、总根长、分枝数相应也发生变化。相关研究表明植物根系会通过改变自身形态和分布来应对土壤中的重金属等非生物逆境胁迫［6-7］。本试验对18个水稻品种的铊吸收能力进行分析，18个水稻品种铊吸收量在55.29～112.01 mg/kg范围内，最高吸收量约为最低吸收量的2倍，吸收量均值为74.86 mg/kg。依据铊吸收能力分为存在差异的4个组对根系长度和根数与铊吸收能力的相关性进行进一步的研究。分析发现根系长度和根数均与铊吸收能力无相关性，根总长和根数并不会影响水稻对铊的吸收能力。在衡量水稻铊吸收量方面，根长和根数并不是主要的影响因素和指标，还需要扩展其他根系性状进行进一步的研究。

其他研究者对根系有机酸分泌和重金属吸收量的研究中发现，植物受到重金属胁迫时植物根系分泌出大量有机分泌物,根系分泌的一些有机酸可与重金属离子形成配位化合物或发生络合反应，降低植物根际环境中有效态重金属离子活性和移动性［19］。在荞麦［20］、小麦［21］、玉米［22］等农作物的研究中发现根系分泌的有机酸如草酸苹果酸等可以螯合重金属离子从而降低植物对重金属的吸收。根系有机酸在植物抗逆应对重金属胁迫中起到十分关键的作用［23-24］。本研究发现，6个品种有机酸分泌量在1.46～2.11 mg/g范围内，最高与最低分泌量之间差异显著。6个品种水稻有机酸分泌与铊吸收量相关系数r=-0.931（P＜0.01），说明铊吸收量与有机酸分泌量呈极显著负相关，有机酸分泌会降低水稻根系对铊的吸收。可能机制是水稻根系草酸分泌促进草酸与铊形成络合物，降低水稻根系对铊离子的吸收能力。这提示我们在研究重金属耐性方面更应该关注植物的生理生化特征，也指明根系有机酸可以作为水稻重金属吸收能力的重要指示指标。

4 结论

本试验结果表明，不同水稻品种铊处理24 h后吸收量在55.29～112.01 mg/kg范围内，铊吸收能力上会有一定的差异。筛选出的6个水稻品种有机酸分泌量在1.46～2.11 mg/g范围内，有机酸分泌量与铊吸收量呈显著负相关，相关系数r=-0.931（P＜0.01），表明不同水稻品种铊吸收量的差异与根系有机酸的分泌呈显著负相关，有机酸分泌会降低水稻对铊的吸收，而与根系长度和根数性状没有相关性。