兜兰花粉活力及柱头可授性研究

宋一岚 张英杰 孙纪霞 张京伟 郭文姣 刘述河 丁朋松 王镭 房义福 刘学庆

摘要 以红魔帝兜兰为试验材料，利用扫描电子显微镜对红魔帝花粉的超微结构进行观察，通过TTC（氯化三苯基四氮唑）染色对红魔帝兜兰的花粉活力进行研究，并用联苯胺-过氧化氢法测定其柱头可授性。结果表明，兜兰随着开放时间的延长花粉变硬，体积变小，花粉块黏性减弱;TTC染色法检测结果表明，花粉活力表现为开花10～30 d>开花10 d>花蕾期;柱头可授性测定结果表明，兜兰开花10～30 d人工杂交成功率较高，其中10～15 d授粉率最高。

关键词 兜兰;花粉形态;花粉活力;柱头可授性

中图分类号 S682.31文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）13-0053-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.017

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Pollen Viability and Stigma Receptivity of Paphiopedilum

Abstract Paphiopedilum maudiaewas used as the research material to observe the ultrastructure of P.maudiae type pollen by scanning electron microscope. The pollen viability of Paphiopedilum maudiae was studied by TTC（2，3，5triphenyltetrazolium chloride） staining. The results showed that with the prolongation of the opening time， the pollen of a paphiopedilum became hard， the volume became smaller and the stickiness of the pollen mass decreased. TTC staining showed that pollen viability was > at 10-30 days after flowering and > 10 days after flowering. Stigma grafting assay showed that the success rate of artificial hybridization was a little higher within 10-30 days after flowering， and the pollination rate was the highest within 10-15 days after flowering.

Key words Paphiopedilum;Pollen morphology;Pollen viability;Stigma receptivity

兜蘭（Cypripedium corrugatum Franch.），又称拖鞋兰，为兰科多年生草本。其喜温暖半阴环境，花型奇特;魔帝类兜兰（P.maudiae）为杂交种，栽培管理容易操作，市场价值较高，目前以无菌播种为主要繁殖方式[1]。兜兰属杂交育种有100年历史，目前已有20 262个杂交种在英国皇家园艺协会（RHS）登录[2]。兜兰杂交育种的成功主要依赖花粉和柱头的高活性，国内外对于花粉活力的测定主要依靠花粉活性染色的方法，染色法多为TTC法[3]。同时，柱头可授性检测方法多为联苯胺-过氧化氢法。目前对兰科花粉形态、活性和柱头可授性的研究很少，国外研究集中在兰科花粉形态学，孙崇波等[3]对兰科5属10种21个品种（系）的花粉块形态学进行研究，喻兰等[11]对“天香公主”蝴蝶兰的花粉活力及柱头可授性进行了研究。笔者通过对红魔帝的花粉形态学、花粉活力及柱头可授性研究，旨在为兜兰红魔帝人工授粉提供技术指导，同时弥补国内对兰科植物花粉形态、活力及柱头可授性研究的不足。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在山东省烟台市农业科学研究院的连栋温室（121°16′26″E、37°29′2″N，海拔6 m）进行，供试材料为红魔帝兜兰。

1.2 兜兰花粉电镜扫描

采取不同花期的红魔帝花粉均匀涂抹在样品托的双面胶带上，经EM ACE200型离子溅射仪喷金后，置于SU8010扫描电子显微镜下观察。选取不同倍数的视野对花粉进行拍照记录。

1.3 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

参照喻兰等[11]的方法，配制新鲜的1.5%TTC染色液，取少量不同花期的红魔帝花粉，将新鲜花粉捣碎置于1.5 mL离心管中，加入1.5%TTC染色液染色。花蕾期花粉常温、黑暗处理12 h后用移液枪取少量花粉混合液于载玻片上，盖上盖玻片在光学显微镜下观察统计花粉活力，开花10～15 d的花粉和盛花期的花粉染色处理24 h后观察，每个开花时期均制片3张，每张片子随机选取5个视野的染色率进行统计分析，有活力的花粉被染色为红色，无活力的未被染色，试验重复3次，拍照记录，计算花粉活力。花粉活力=有活力的花粉/观察花粉总数×100%。

1.4 柱头可授性检测

采用联苯胺-过氧化氢法测定红魔帝柱头可授性。配制新鲜的联苯胺-过氧化氢反应液（1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22）[11]，于10：00采集不同开花时期的新鲜雌蕊柱头置于培养皿中，在培养皿中加入适量联苯胺-过氧化氢反应液，10 min后观察柱头颜色和气泡变化。无气泡和颜色变化的柱头视为无可授性，有少量气泡和少许颜色变蓝的柱头具有可授性，柱头有超过2/3颜色变蓝及大量气泡产生的为具有可授性且可授性强。