溃疡性结肠炎患者miR-21和miR-206的表达及临床意义

李 红，刘震雄，窦维佳

(1.西安交通大学第二附属医院消化内科，西安 710004； 2.空军军医大学(第四军医大学)唐都医院消化内科，西安 710038)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn′s disease,CD)，其中UC为局限于直肠和结肠黏膜层的慢性非特异性炎症性疾病，临床主要表现为黏膜溃疡，可出现腹痛、腹泻或黏液脓血便等[1]。研究显示，我国UC发病率呈逐年升高趋势，严重影响患者的生活质量[2-3]，然而发病机制目前尚不明确。微RNA(microRNA,miRNA)是一组内源性非编码RNA分子，与目标基因mRNA的3′非翻译区特异性结合，在转录后水平抑制目标基因的表达，因所调节下游基因功能的不同，miRNA发挥不同的作用[4]。研究发现miRNA可介导机体免疫调节、内质网应激、肠道屏障功能和微生物群相互作用等多种过程，最终诱发肠道慢性黏膜炎症[5-6]。如Paraskevi等[7]研究发现，UC患者和健康人群miRNA表达比较差异有统计学意义，故推测miRNA可能参与UC的发生、发展；Schönauen等[8]研究发现miR-16、miR-21及miR-223在UC患者血清中的表达水平显著高于健康对照；Minacapelli等[9]研究发现活动期UC患者肠黏膜组织中的miR-206表达较健康对照及缓解期UC患者明显上调，但仍未阐明UC的发病机制。本研究拟检测UC患者外周血miR-21及miR-206的表达情况，并与健康人群进行比较，旨在探讨miR-21及miR-206与UC发病的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年3月至2018年3月空军军医大学(第四军医大学)唐都医院消化内科住院部及门诊部诊治的UC患者作为研究对象。入选标准：①符合IBD的诊断标准[10]；②年龄≥18岁，性别不限；③存在持续或反复发作的腹痛、腹泻及黏液脓血便等症状；④结肠镜检查可见从直肠开始连续、弥漫分布的糜烂、溃疡，黏膜血管纹理模糊、紊乱、消失，或结肠袋变浅、消失，假性息肉和桥形黏膜等；⑤患者或家属均签署知情同意书。排除标准：①并发胃肠道肿瘤；②并发细菌、病毒、结核等感染性结肠炎；③并发缺血性结肠炎；④并发其他型类型的自身免疫性疾病。最终共入选42例患者作为观察组，其中男22例、女20例，年龄19～67岁，平均(41±13)岁。选择同期在本科门诊进行结肠镜检查且未发现器质性疾病的42名健康体检者作为健康对照组，其中男26例、女16例，年龄21～77岁，平均(47±14)岁。两组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1主要试剂和仪器 Trizol LS试剂盒(美国Invitrogen公司生产，批号：10296-028)，PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(日本TaKaRa公司生产，批号：RR037Q)和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(日本TaKaRa公司生产，批号：RR820Q)，4 ℃微量高速离心机(德国Eppendorf公司)，分光光度计(美国Bio-rad 公司)，实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(瑞士Roche公司)。

1.2.2标本采集 采集入选研究对象清晨空腹肘部静脉血10 mL，置于干燥的无菌试管中，室温静置，待其凝固后，置4 ℃(静置离心后获得血清，可用低温离心机保证温度)，以1 006.2×g，离心10 min，取上清液，置于无RNA酶的无菌试管中，保存于-80 ℃冰箱中待统一检测。

1.2.3引物合成 所有均由上海生工生物工程公司合成，具体引物序列：miR-21上游引物5′-3′是GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG，下游引物5′-3′是GTGCAGGGTCCGAGGT；miR-206上游引物5′-3′是TGGAGACTTCTGAACGAGAG，下游引物5′-3′是CTTGAAGATGGCGTTGGG；U6上游引物5′-3′是CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物5′-3′是AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4qRT-PCR检测miRNA表达 ①RNA提取：取250 μL上清液，严格按照Trizol LS试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度法测量OD值及RNA水平。②逆转录：取2 μL RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书合成cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。③PCR扩增：以cDNA为模板应用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)试剂盒进行PCR检测，反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(共40个循环)。采用2-△△Ct法，以U6作为内参，分析miRNA相对表达情况，每个样本设置3个复孔，实验重复3次。

1.3观察指标 比较两组受试者miR-21和 miR-206 表达情况。对UC患者血清miRNA表达情况与UC临床特征的进行相关性分析时，以组内全部患者血清miR-21及miR-206表达量的平均值作为截点，高于UC组患者血清miR-21和miR-206表达量的平均值者判定为高表达，反之，判定为低表达。

2 结 果

2.1两组受试者miR-21和miR-206表达情况比较 观察组miR-21和miR-206的表达量明显高于健康对照组(P<0.01)，见表1。

组别例数miR-21miR-206健康对照组421.11±0.361.21±0.65观察组 422.32±0.663.33±0.86t值12.41913.508P值<0.001<0.001

健康对照组：健康体检者；观察组：溃疡性结肠炎患者

2.2UC患者miR-21和miR-206表达情况与临床特征的相关性分析 观察组患者中血清miR-21低表达15例，高表达27例；血清miR-206低表达11例，高表达31例。UC患者活动期的血清miR-21及miR-206高表达率高于缓解期患者(均P<0.05)，不同性别、年龄、病变部位、疾病分级的miR-21和miR-206高表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 UC患者miR-21和miR-206表达情况与临床特征的相关性分析 (例)

UC：溃疡性结肠炎；a为校正χ2值

2.3UC患者血清miR-21与miR-206表达量的相关性分析 Pearson相关分析结果提示：UC患者血清miR-21表达量与血清miR-206表达量呈正相关(r=0.396，P=0.009)，见图1。

图1 42例溃疡性结肠炎患者血清miR-21与miR-206表达量的相关性分析

3 讨 论

IBD是一种胃肠道特发性炎性疾病，病因多样、机制复杂。虽然有研究表明，遗传因素、环境因素和宿主免疫系统之间复杂的相互作用可能在IBD中发挥重要作用[11-12]，但具体机制尚不十分清楚。

miRNA是一类含19～24个核苷酸的非编码RNA分子，可通过调控目标基因mRNA的翻译和稳定性，在转录后水平参与调节细胞基因表达[13]。研究发现，miRNA介导细胞增殖、凋亡、分化及血管生成等行为[14]，在肿瘤进展、器官纤维化、组织瘢痕愈合等多种疾病和病理生理过程中发挥关键作用[15]。近年来有研究表明miRNA的表达变化及其调节功能同样参与IBD、类风湿关节炎、哮喘和系统性红斑狼疮等免疫性疾病的发生发展，并在其中扮演重要角色[16-17]。miR-21是较早发现的miRNA,广泛存在于多种生物及哺乳动物的多种组织及细胞中，既往对miR-21的研究多集中于肿瘤方面，大量研究证实miR-21通过下调多种抑癌基因的表达发挥促癌作用[18-20]。然而，近年来miR-21在IBD中的作用越来越受到关注。Svrcek等[21]研究发现IBD患者肠黏膜组织中miR-155及miR-21均呈高表达，且通过抑制巨噬细胞甘露糖受体发挥作用。有研究表明，CD及UC患者血清miR-16、miR-21及miR-223表达水平均显著高于健康对照，其中miR-16、miR-21及miR-223在CD患者中上调更为明显[8]。Shi等[22]研究发现，miR-21在肠道黏膜炎症和损伤组织中呈过表达，而敲除小鼠体内miR-21可降低黏膜炎症反应和组织损伤，从而提高葡聚糖硫酸钠诱导的致死性结肠炎的生存率。因此，下调肠道miR-21的表达可以预防IBD患者疾病的发生、发展。另有体内外研究试验表明，miR-206在UC中的表达量显著上调，通过直接抑制A3腺苷受体表达，在炎症反应中发挥促炎因子的作用[23-24]。以上研究均提示，miR-21及miR-206在UC中呈差异表达，并可发挥重要的调节功能。本研究结果显示，观察组患者血清miR-21及miR-206的表达量均明显高于健康对照组(P<0.01)。

UC为作为结直肠黏膜慢性非特异性炎症性疾病，其病变部位、疾病分期及分级等不同临床特征与患者生活质量密切相关，并严重影响患者预后。Chen等[25]利用RT-PCR方法分别检测CD、UC及健康对照者血清miRNA水平，发现与健康对照者相比，CD和UC患者的血清miR-146b-5p表达显著升高，且其表达水平与疾病活动性密切相关，较C反应蛋白更具特异性。研究发现miR-15在UC患者肠黏膜组中呈显著高表达，通过激活核因子κB级联反应抑制A2A腺苷受体蛋白表达，从而调节UC炎症及免疫反应[26]。活动期UC患者结肠黏膜中miR-141呈低表达，并通过抑制CXC趋化因子配体 5及激活蛋白激酶B信号通路发挥调节作用[27]。UC患者应用美沙拉嗪治疗可下调肠黏膜组织中miR-206的表达水平，促使组织炎症得到控制并使疾病长期维持在缓解期，提示miR-206表达水平可以作为预测UC患者对美沙拉嗪治疗反应性的生物标志物[9]。本研究进一步分析结果显示，UC患者活动期的血清miR-21及miR-206高表达率高于缓解期患者(均P<0.05)，即miR-21及miR-206表达在活动期较缓解期显著升高，说明miR-21及miR-206表达水平对UC患者的疾病活动程度具有一定的提示作用。相关性分析显示UC患者外周血血清中miR-21与miR-206表达呈正相关，即miR-21高表达时，miR-206亦呈高表达。

综上所述，miR-21及miR-206在UC患者外周血血清中呈显著高表达，且两者表达呈明显正相关，而高表达miR-21及miR-206均提示UC处于疾病活动期，以上结果提示miR-21及miR-206在UC中发挥重要调节作用，有望成为预示疾病进展的重要分子标志物及临床治疗的潜在新靶点，但具体分子机制仍有待进一步深入研究。