赵婉君,张 勇,付琳茹,杨 浩,朱精强
(1.四川大学华西医院 a.甲状腺外科, b.移植免疫研究室/华西-华盛顿线粒体与代谢研究中心,成都 610041;2.四川大学华西临床医学院,成都 610041)
甲状腺癌作为内分泌最为常见的恶性肿瘤[1],其发病率近年来呈快速增长趋势,有研究显示2008年以来患病率较1998—2008年翻了2倍[2]。2015年癌症中心统计表明甲状腺癌已成为美国女性恶性肿瘤的第5位[3],韩国女性恶性肿瘤的第1位[4]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)来源于甲状腺滤泡上皮细胞,作为甲状腺癌最常见的病理类型,占比高达90%[1,5],PTC患者男女比例为1∶3.69,中位诊断年龄为50岁[6]。PTC作为浅表软组织肿瘤,具有发病隐匿、早期无明显临床表现、良恶性识别难度高、淋巴结转移迅速的特点[7]。现有研究表明,PTC发生发展是长期、多因素、分阶段的复杂过程,由多基因[如鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)、甲状腺滤泡细胞发生大鼠肉瘤癌基因(RAS)、RET(RET proto-oncogene)、p53等][8]和环境因素(放射接触史、碘摄入等)[9-10]共同参与,但具体机制尚不明确[6]。除此之外,目前筛查主要依靠甲状腺专科彩色多普勒超声,诊断金标准为超声引导下细针穿刺活检,有创且需要病理专家的配合,基层医院难以开展[11]。此外,临床上缺少高敏感性和特异性的分子诊断标志物以及识别复杂难治病理的关键标志物。因此,筛选甲状腺肿瘤分子标志物在术前判断甲状腺肿瘤良恶性以及精细化区分PTC的侵袭性亚型也是临床的迫切需要,将使部分患者避免不必要的外科手术,提高治愈率。现对基于生物质谱的蛋白质组学在PTC的诊断、分型和预后等方面的研究进行总结,为PTC的诊疗发展提供新的思路和依据。
2001年,人类基因组测序计划的完成促使科学家对人类基因组的功能进行研究[12-13]。随着基于生物质谱的蛋白质鉴定技术的发展,标志着“蛋白质组学”这一全新领域的诞生,其以蛋白质组为研究对象,从整体的角度分析细胞、组织、器官动态变化的蛋白组成和活动规律[14]。蛋白质组学的核心技术是生物质谱技术,通过测定质荷比进行蛋白质组成和结构分析,离子化方式主要分为基质辅助激光解析电离[15]和电喷雾电离[16],具有高通量、高灵敏度、低检测线、自动化等特点[17-18]。蛋白质组学能够破译基因的编码信息,包括氨基酸序列、翻译后修饰、蛋白质-蛋白质相互作用等[19]。2014年,《自然》杂志的一篇文章公布了人类蛋白质组草图,全面覆盖了超过80%的人类预期蛋白质组,还发现了一些新的蛋白质,为人类肿瘤蛋白质组学研究奠定了基础[20]。2019年2月,中国肝细胞癌蛋白质组学研究也取得了突破性成果,提出了基于蛋白质组学的早期肝癌分型以及靶向治疗靶点[21]。在基因表达成蛋白质的过程中,多种影响因素决定肿瘤的表型,包括基因组、转录组以及蛋白质组水平的改变。根据“中心法则”,蛋白质组水平与肿瘤表型关系最为密切,蛋白质表达量、稳定性及修饰的改变等都可能影响蛋白质的功能[22]。借助先进的生物质谱技术,研究生物体内肿瘤发生、发展相关蛋白质组的变化规律,有助于发现肿瘤早期诊疗相关生物标志物和治疗靶点[23]。肿瘤细胞和正常细胞由于基因功能表达以及蛋白质组成等方面的不同会导致生物学行为差异,因而通过比较两者之间蛋白质种类、表达量、修饰状态的差异,分析差异表达蛋白质的结构与功能,可能找到与肿瘤诊断、分子分型、精准治疗相关的高特异度和高灵敏度蛋白质标志物,揭示肿瘤发生、发展的分子机制。Zhang等[24]对95例结直肠癌样本进行基于质谱的蛋白质组学分析,并基于蛋白质组学结果将其分成了5种亚型,并第一次综合分析了人类癌症的“蛋白组-基因组学”特征,推动了结直肠癌诊断和治疗的发展。Mertins等[25]对105例乳腺癌样本进行基于质谱的定量蛋白质和磷酸化修饰分析,展现了基于质谱的高通量蛋白质组技术在癌症分子分型中的能力。Zhang等[26]对169例高级别浆液性腺癌的卵巢癌样本进行了基于质谱的蛋白质组分析,鉴定到一些关键蛋白质,与基因组数据整合对该疾病提出了一些新的见解。Ge等[27]对84例弥漫性胃癌样本进行了定量蛋白质组学研究,并根据蛋白质组结果将其分成3个亚型,揭示了一些潜在的治疗靶点。总之,基于生物质谱的肿瘤蛋白质组学展示出越来越强的能力,为理解肿瘤生物学提供了新思路,并推动肿瘤诊疗向精准医疗方向发展。
研究表明,PTC的生物学行为差异较大,有终生无变化的微小癌,也有血管侵袭、血性播散至肺、肝、骨和脑等高死亡特性的肿瘤,但是造成这种差异的机制不明[28-30]。现有关PTC发生、发展的研究多集中于基因层面,大多数典型PTC与鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1 V600E的突变具有显著相关性[31]。此外,研究还发现PTC与大鼠肉瘤癌基因、RET、端粒酶逆转录酶基因、p53等有直接或间接的关系[32]。另有研究发现微RNA(microRNA,miRNA),如miR-146、miR-221、miR-222、miR-155、miR-181等的上调对PTC的发生发展有重要作用[20]。但基因突变、mRNA的改变与最终蛋白表达的功能实现有显著差异。因此,针对蛋白质功能实现的靶向筛选还有很大的研究空间。如何通过分子层面找到PTC的关键靶点,是病因探索的方向,同时也是寻找靶向药物的前提和基础。对于雌激素、碘摄入、桥本甲状腺炎等因素对PTC发生发展影响作用的研究仅停留在发现临床现象层面,并未深入明确其相互影响的作用机制,这也是临床较为关注的热点问题。
早期诊断对PTC至关重要,细针针吸细胞学是目前诊断PTC最行之有效的方法。然而,其对病理科医师的专业经验及能力要求较高,即使是从业10年的病理科医师也仍有15%~30%无法明确诊断[20]。无法判断的病理表现为滤泡上皮细胞的不典型增生和细胞特点的不典型性,人工难以鉴别。同时,细针针吸细胞学本身为有创操作,患者接受度不高,作为一种检查手段对患者身心影响较大。因此,寻找体液内(血液、尿液等)更为敏感可靠的肿瘤标志物以提高诊断效能,对于PTC的早期检测、更好的分类和最佳治疗极为必要。关于PTC亚型的分类国内目前开展较少,主要原因是专科病理诊断能力不足,但精准的亚型分型(如高细胞亚型等)识别有助于临床鉴别生物行为不良的PTC,尽早干预,提高患者预后。因此,寻找到更为精准地区分PTC生物学行为的关键标志物,找到PTC腺内播散、淋巴结转移、远处转移生物学行为的关键靶点,以它们作为新的分型标准将更好地指导PTC的临床决策。
目前国际上针对PTC手术策略的争论点在于手术方式及手术范围的选择[33-34]。PTC初始治疗的主要目标是降低癌症死亡率,降低复发风险及相关手术并发症发生风险,同时提高整体或疾病特异生存率。现阶段针对低复发风险(美国癌症联合委员分期)、微小癌(癌灶直径<1 cm)是否过度治疗的讨论成为热点。同时针对术前评估仅为孤立癌灶的患者是否进行全切和侧叶切除,以及是否进行预防性中央区淋巴结清扫也存在争议。甲状腺全切或预防性淋巴结清扫的支持者认为无论是在甲状腺本身还是在局部淋巴结中,隐匿性疾病的高发均是PTC的显著特点,彻底的手术方式可以降低疾病复发率,减少再次手术风险[35]。全切后可以加做131I放射辅助治疗,提高患者无病生存率[36]。同时,甲状腺全切后加做131I放射辅助治疗可以使血清甲状腺球蛋白成为术后复发的敏感标志物,提高监测准确性[36]。但其意味着更高的手术并发症发生率(喉返神经损伤及甲状旁腺功能减退等)和终生激素替代治疗[20]。上述问题的本质在于现有的PTC分期分型精准度对手术方式选择指导的适用度不够。如果能够通过现有的技术,将目前认为微小癌或低复发风险PTC中的生物学行为不良的类型加以识别,精准化手术策略的选择,将手术风险及手术效果维持在适度的平衡状态会大大提升患者术后的生存质量及预后。
131I是治疗术后复发转移以及远处转移(广泛肺转移)的主要武器,但是转移灶的131I摄取能力是良好治疗效果的前提。在临床实践中,约有30%伴远处转移的PTC患者转移灶显示出去分化特性,从而碘耐受[20]。目前针对碘耐受伴广泛肺转移的患者并无有效的治疗手段,大剂量131I的使用反而给患者带来不必要的并发症,影响生活质量。与此同时,PTC去分化机制尚不明确。因此,如何早期识别碘耐受患者或寻找PTC去分化的关建作用点是突破碘耐受PTC治疗的首要前提。
蛋白质组学研究的方法主要包括收集样本、提取蛋白、将蛋白酶切成肽段、肽段分级、质谱分析、数据处理、生物信息学分析等步骤。而每个步骤都存在一些挑战,需根据实际情况优化和应对。目前PTC的相关研究较少,对于其体液和组织的研究仍存在一些挑战,如对于PTC血浆或血清蛋白质组的研究主要在于高峰度蛋白的存在,蛋白质浓度动态范围高达12个数量级,蛋白质种类复杂,存在大量蛋白质变体等[37]。
3.1PTC蛋白质组学研究 Wilhelm等[20]发表的基于生物质谱人类蛋白质组草图中,在正常人甲状腺中鉴定出2 791个蛋白质,为甲状腺癌中蛋白质组变化提供了参考。而PTC蛋白质组研究仍然有限,原因包括早期生物质谱技术以及临床样品获取等方面的限制,以及PTC作为治愈率最高的癌症受到研究者的重视度不够。Sofiadis等[38]对PTC和甲状腺滤泡状癌的蛋白质组进行了表征,采用二维凝胶电泳技术和质谱技术发现了25个差异蛋白点,如膜联蛋白A5,但是该方法通量低,准确度不高。Ban等[39]利用质谱技术从PTC组织和匹配的正常组织中分别鉴定到524种和432种蛋白质,其中145种蛋白质在癌组织中特异表达,并发现肾连蛋白和malectin 蛋白可能作为PTC的特征生物标志物,在正常与癌组织区分方面展示出蛋白质组优于基因组的能力。陈国群和周亚东[40]探讨了甲状腺包裹性滤泡型乳头状癌与普通型乳头状癌的蛋白组学,发现了差异表达的蛋白质,有助于甲状腺包裹性滤泡型乳头状癌的早期诊断。在PTC的组织样本中,人们还发现半乳凝集素3、S100-A6蛋白、组织蛋白酶B、角蛋白19等可作为PTC的良好标志物[41-42]。目前,PTC蛋白质组覆盖度还不深,研究对象还不全面,目前发现并验证的差异蛋白质组还不丰富,缺少高灵敏性和高特异性的生物标志物。总之,对PTC蛋白质组学进行深度解析,还需要临床工作者和基础研究人员共同努力和协作,建立PTC组织、细针穿刺液、血清、尿液蛋白质组诊断模型,用于PTC早期诊断、术前判断、分期分级、精准治疗、预后判断等[43-44]。
3.2PTC糖蛋白质组学研究 糖蛋白质组是蛋白质组的一个分支。糖基化是蛋白质最广泛、最复杂的翻译后修饰之一,广泛参与细胞识别、黏附、信号转导等生物学过程,对于蛋白质的正确折叠、功能定位、胞内运输等十分关键,其异常表达与肿瘤等疾病的发生、发展密切相关[45]。糖基化根据其连接氨基酸的不同主要分为N-糖基化和O-糖基化两大类,糖链结构复杂多样,糖基化的微观不均一,糖基化修饰丰度低,在质谱分析前往往需要先富集糖链或糖肽,并需要通过专业的软件进行分析[46]。目前美国食品药品管理局批准的肿瘤蛋白质标志物中1/3以上是糖基化修饰蛋白,如肝癌的诊断标志物甲胎蛋白[47],因而研究PTC糖蛋白质组有助于发现新型标志物,帮助人们深入理解其发病机制。
甲状腺作为内分泌器官对于代谢调控、生长发育非常重要,其腺体内含有大量的糖蛋白,包括甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺激素、促甲状腺激素受体等。一旦该器官发生癌变,其糖基化修饰也会异常变化,包括唾液酸化、岩藻糖基化、糖型分枝情况等[48]。研究者观察到甲状腺癌中甲状腺球蛋白的唾液酸化程度下降[49],核心岩藻糖转移酶8蛋白的表达量升高与PTC肿瘤大小与淋巴结转移相关[48,50]。但是目前关于PTC的糖蛋白质组研究较少,人们对其含有的糖蛋白质种类变化、表达量变化、糖基化结构变化、糖基化位点变化、糖基化修饰变化等情况还不了解,需要先进的分析方法和技术进行阐明。
目前关于PTC的发病机制、诊断精准度、治疗策略等方面的研究中还有很多问题未解决,这也是将基于生物质谱的蛋白质组学应用于PTC研究的切入点。尽管基于生物质谱的蛋白质组学目前在乳头状甲状腺癌研究中还存在很多困难和挑战,但是随着生物质谱技术的进步、蛋白质组学方法的成熟,越来越多的研究者将目光聚焦到甲状腺癌血浆、尿液等生物样本中。通过创新的方法和策略筛选可应用于无创或微创诊断、分型以及预后的分子标志物,包括差异表达的蛋白质、糖基化修饰等,并为研究癌症发病机制提供新的证据,为开发生物治疗药物提供新的治疗靶点和思路。