山西老陈醋风味物质组成特征及风味轮分析

郑 宇， 赵翠梅， 吴亚楠， 刘 静， 程 程，石 磊， 万守朋， 王 敏,*

(1.食品营养与安全国家重点实验室/天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心/天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.天津市利民调料有限公司，天津 300308)

作为山西地理标志产品，山西老陈醋以其独特的色、香、醇、浓和酸五大特征闻名于世[1]，其酿制工艺被列为国家级非物质文化遗产。山西老陈醋是以高粱、麸皮、谷糠和水为主要原料，以大麦、豌豆所制大曲为糖化发酵剂，经酒精发酵后，再经固态醋酸发酵、熏醅、陈酿等工序酿制而成[2]。由于酿造原料丰富，酿造工艺独特，参与发酵的微生物种类众多，赋予了山西老陈醋独特的风味。

食醋的整体风味主要由气味和滋味，即挥发性成分和不挥发性成分两部分组成。挥发性成分包括挥发性酸类、酯类、醇类、醛类、杂环化合物等[3]，不挥发性成分主要由有机酸、氨基酸、糖类组成，其中，酸味和鲜味是食醋给人的主要感官感受，有机酸和氨基酸对其风味影响较大[4]。顶空固相微萃取- 气相色谱- 质谱联用(HS-SMPE-GC-MS)技术可用于提取和鉴定山西老陈醋中的挥发性成分[5-6]，结合气相色谱- 嗅辨仪联用(GC-O)技术可对其中主要化合物的风味特征进行分析[7]。在感官分析中，不同物质的感官阈值差异很大[8]，挥发性成分和不挥发性成分对食醋整体风味的贡献是由其在食醋风味体系中的浓度和感觉阈值共同决定的[9-10]。相对气味活度值(ROAV)法[11]可以将风味化合物的浓度和阈值联系起来，按照挥发性物质的香气属性将其分类，并把同类香气属性的挥发性物质的ROAV值相加，以各类香气属性ROAV值总和绘制香气轮。香气活性值香气轮的优势在于可以将化学信息转化为感官描述信息，虽然香气活性值香气轮不能代替感官香气轮，而感官香气轮往往需要专业品评人员，且受主观感受差别大。在感官分析条件不具备时，香气活性值香气轮可以初步描绘样品的感官信息[12-14]。

山西老陈醋具有悠久的历史，随着技术的进步，自动翻醅机、机械熏醅罐等设备逐渐应用于山西老陈醋的生产[7,11]，但目前对山西老陈醋风味分析研究仍不够深入，缺乏客观的风味评价依据，企业在进行技术升级和设备改造的时候缺乏有效的评价手段来指导工艺的优化。采用HS-SMPE-GC-MS、HPLC和氨基酸自动分析仪等设备分析不同品牌山西老陈醋挥发性成分、有机酸和氨基酸等主要风味物质组成，特别地，采用ROAV和味觉强度来描绘山西老陈醋风味特征，可以为建立科学、统一的山西老陈醋感官评价体系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 山西老陈醋样品

分别从山西太原、晋中等地选购不同厂家山西老陈醋样品，为便于分析比较，所购样品陈酿时间均为3年，总酸为6.0～6.5 g/(100 mL)，6个品牌样品编号分别为1～6。

1.2 仪器与试剂

6890N-5975B型气相色谱- 质谱联用仪，美国Agilent科技有限公司；固相微萃取装置包括手柄、导向杆、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头，美国Supelco公司；1200型高效液相色谱分析仪(紫外检测器)，美国Agilent科技有限公司；S-433D型氨基酸自动分析仪，德国SYKAM公司；电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；NaCl(分析纯)，天津市天力化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1挥发性风味成分分析

1.3.1.1 固相微萃取条件

将萃取纤维头于250 ℃下老化20 min，直至无干扰峰出现。取2.0 mL食醋、6.0 mL去离子水加入样品瓶中，并加入1.0 g NaCl、1.0 μL 1.6 mg/mL 2-辛醇(内标)和搅拌子，盖好后置于60 ℃的恒温水浴中。将萃取头插入瓶中，推出纤维头使之与醋液面保持2 cm的距离，萃取时间为40 min，搅拌速度为200 r/min，然后抽出纤维头，再将萃取头插入气相色谱进样口，同时启动仪器，采集数据，待纤维头于230 ℃解吸5 min后抽出纤维头。

1.3.1.2 GC-MS分析条件

GC条件：进样口温度220 ℃，柱流速为恒定流量1 mL/min，分流比为5，程序升温起始温度40 ℃，以4 ℃/min升到150 ℃，然后以8 ℃/min升到250 ℃保持6 min。MS条件：接口温度220 ℃，离子源温度230 ℃，数据采集模式全扫描，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 35～500。所得质谱数据与NIST数据库对照，对匹配度大于80(最大为100)的鉴定结果予以确认，利用图谱库工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行定量分析，求得各样品中挥发性风味物质成分的相对含量。

1.3.2有机酸分析

1.3.2.1 HPLC分析条件

取2.0 mL样品稀释液于2 mL EP管内，12 000 r/min转速离心5 min后取上清液，滤液经0.45 μm滤膜过滤后，采用HPLC法检测每个样品。色谱柱：Aminex HPX-87H lon Exclusion Column(7.8 mm×300 mm)，柱温30 ℃，流速0.6 mL/min，紫外检测器波长215 nm，流动相为5 mmol/L硫酸，运行时间为30 min。

1.3.2.2 主要有机酸浓度测定

将乙酸、乳酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等标准品储存液稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样并确定保留时间。绘制标准曲线，用于样品中有机酸的定量分析。

1.3.3游离氨基酸分析

1.3.3.1 氨基酸自动分析仪检测条件

将醋样稀释20倍，取200.0 μL稀释后的样品加入800.0 μL 2%的水杨酸，静置30 min后，13 000 r/min离心15 min，取离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，待测。采用氨基酸自动分析仪，检测柱为Na+型阳离子分离柱(LCA K06)，柱温为30～70 ℃，紫外检测器波长440～570 nm，缓冲液为钠盐缓冲液，流速为0.45 mL/min。梯度洗脱衍生试剂为茚三酮溶液，流速0.25 mL/min，进样量50 μL，分析时间60 min，反应温度130 ℃。

1.3.3.2 氨基酸的定性与定量分析

将SYKAM公司原装H型氨基酸标准溶液稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样并确定保留时间。绘制氨基酸系列标准曲线回归方程，用于样品中氨基酸的定量分析。

1.3.4主要风味成分评价方法

1.3.4.1 挥发性风味成分[11]

对于特征风味成分的确定采用ROAV法，评价各挥发性成分对样品整体香气的贡献，即：

(1)

式(1)中：Ci、Ti，各挥发性物质的相对含量(%)和对应的感觉阈值(mg·L-1)；Cmax、Tmax，对样品总体风味贡献最大的组分的相对含量(%)和对应的感觉阈值(mg·L-1)。

1.3.4.2 不挥发性风味成分

计算有机酸、游离氨基酸对滋味的贡献度，即味觉强度值(TAV)，表示为各个呈味物质的含量与其阈值的比。当TAV大于1时，认为该物质对呈味有贡献，而当TAV小于1时，认为该物质对呈味没有贡献。

1.3.5风味轮的绘制

1.3.5.1 香气轮的绘制

由挥发性物质根据文献检索的信息，将同一香气属性的挥发性物质的ROAV相加，即为山西老陈醋该香气属性的得分，将各个香气属性的得分绘制成雷达图，即为山西老陈醋的香气轮。

1.3.5.2 滋味轮的绘制

将不挥发性物质的味觉属性分为酸、甜、苦、鲜四大类，计算各个化合物的味觉强度，并归纳相加，由其各个属性得分绘制雷达图，即为山西老陈醋的滋味轮。

2 结果与讨论

2.1 山西老陈醋中主要风味物质分析

2.1.1挥发性成分定性定量分析

应用固相微萃取- 气相色谱- 质谱联用仪对山西老陈醋中挥发性风味成分进行测定，共测定出95种风味成分，实验结果见表1。根据鉴定结果，检测出挥发性风味成分主要包括酸类、醇类、酯类、醛类、酮类和杂环化合物等。乙酸是食醋中最主要的挥发性风味物质，对食醋的风味有重要影响，但受到固相萃取效率、解吸附效率等方面的影响，HS-SPME-GC-MS方法并不适合检测乙酸浓度。因此本研究采用HPLC法对乙酸等有机酸浓度进行分析，并在HS-SPME-GC-MS数据中删除乙酸相对浓度。由表1可见，除乙酸外，山西老陈醋中挥发性风味成分相对含量较高的是糠醛、乙酸乙酯、2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮和四甲基吡嗪，相对含量分别为38.12%、3.07%、3.05%、3.38%和6.48%。

2.1.2挥发性香气化合物ROAV 特性分析

山西老陈醋中主要的挥发性风味物质分为7类，包括酸类、酯类、醇类、醛类、酮类、吡嗪类和酚类。对鉴定的6个样品中共有的20种风味化合物在山西老陈醋中的特征进行了分析，结果如表2。表2中，ROAV≥1.00的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.10≤ROAV<1.00的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用[11]，其主体香气成分有以下5种：乙酸、苯甲醛、糠醛、2,3-丁二酮和四甲基吡嗪。

酸类、醛类和吡嗪类是山西老陈醋中的主要呈香物质，其次是酮类和酯类化合物，不同的挥发性成分具有不同的香气贡献。酸类物质作为山西老陈醋香气的主要构成物质既是呈味物质又具香气特征，决定了食醋的风味和品质，其中乙酸具有愉快的酸香气味，3-甲基丁酸、己酸具有明显的干酪味、酸臭味以及窖泥香风味，在食醋中其他组分的协调作用下，构成食醋独特的风味[18-19]。醛类物质是通过微生物的发酵作用或者氨基酸的降解作用产生的，其中苯甲醛，又称安息香醛，是工业上最常使用的芳香醛，具有特殊的杏仁气味；糠醛，亦称2-呋喃甲醛，具有甜香、木香、面包香和焦糖香，并带有烘烤食品的气味[20]。吡嗪类物质是山西老陈醋熏醅过程中产生的特有香气物质之一，主要是通过Strecker降解反应将氮源(如氨基酸)降解而成的，其中四甲基吡嗪又称川芎嗪，具有咖啡味、烘烤花生味等特殊香气，此外还具有降血压等功效。由方差分析可知，在不同厂家的山西老陈醋中，不同物质ROAV差别较大，其中3-甲基丁酸、苯甲醛在各样品中差异显著，且乙酸苯乙酯、糠醇、5-甲基糠醛、三甲基吡嗪等物质ROAV的差异极其显著，因山西老陈醋采用的主要原料和生产工艺类似，这些香气成分有可能是不同厂家在原料配比和发酵过程控制方面的差异导致的；同时，也说明这些存在差异的风味特征容易受到生产过程操作的影响，这些风味特征也应该是各生产企业在发酵过程控制和新设备、新工艺的应用时需要特别注意的。

表1 山西老陈醋风味成分相对含量

续表1

续表1

“-”，未检测到该化合物或在检测限以下。

表2 山西老陈醋香气成分阈值分析

“-”，P>0.1，差异不显著；“*”，P<0.1，差异显著；“**”，P<0.05，差异极显著。

2.2 山西老陈醋有机酸风味分析

利用HPLC法对6个品牌的山西老陈醋样品中的主要有机酸进行了分析，共检测了7种有机酸，其中含量较高的有机酸依次是乙酸(54.00～56.10 mg/mL)、乳酸(29.37～32.63 mg/mL)，其次为柠檬酸(1.69～1.95 mg/mL)、琥珀酸(1.31～1.57 mg/mL)和酒石酸(0.76～0.92 mg/mL)等。乙酸和乳酸是山西老陈醋的主体有机酸，且二者分别属于挥发酸和不挥发酸，除乳酸外，酒石酸、柠檬酸和琥珀酸等同属不挥发酸，能够调和食醋的酸味，减少乙酸对味觉的刺激，使得食醋口感更加柔和。

根据每种有机酸含量及对应的味觉阈值，判断有机酸的味觉强度，以此来分析每种有机酸对山西老陈醋的整体酸味贡献情况。味觉强度TAV越大，说明贡献越大，当TAV<1时，味感可忽略不计。山西老陈醋中每种有机酸的味觉强度情况见表3。表3中，乙酸、乳酸的味觉强度占其总酸味强度比分别为61.31%～65.08%、32.46%～35.94%，柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸和草酸占比分别为0.88%～1.00%、0.74%～0.84%、0.33%～0.43%、1.13%～1.46%、0.039%～0.053%。乙酸、乳酸不仅是山西老陈醋中浓度最高的主体酸，也是对产品风味贡献最大的两种有机酸，其他有机酸作为辅助整体酸味味感的特征成分，协同主体有机酸形成山西老陈醋独特的酸味口感。柠檬酸具有清爽，带新鲜感刺激的酸味；琥珀酸是酵母菌发酵的代谢产物，具有鲜酸爽口的滋味[22]；苹果酸是特有的有机酸，带有刺激的、爽快的酸味。由显著性分析可知，不同样品有机酸的滋味贡献差别较大，除乳酸外，其余6种有机酸TAV差异极显著(P<0.05)，可能与不同企业的发酵过程控制相关。食醋中的大部分有机酸是在制曲和发酵过程中由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物产生的，而微生物的代谢受环境影响巨大。6种样品虽同为山西老陈醋，但在生产过程中人为或机械操作、条件控制等不尽相同，进而形成了有机酸含量的差异。

表3 山西老陈醋中有机酸风味强度分析

“*”，P<0.1，差异显著；“**”，P<0.05，差异极显著。

2.3 山西老陈醋中氨基酸风味分析

采用氨基酸自动分析仪对食醋样品中的氨基酸成分进行测定，共检测了15种氨基酸(表4)。各样品中氨基酸种类组成情况差异不大，其中天冬氨酸(7.1%～10.2%)、谷氨酸(6.9%～8.8%)、丙氨酸(14.6%～19.7%)、胱氨酸(1.4%～18.5%)、缬氨酸(7.5%～8.7%)、亮氨酸(7.5%～11.3%)和脯氨酸(4.8%～8.1%)含量较高。相关文献对中国传统食醋主要酿造原料高粱、糯米、小麦麸皮的氨基酸组成分析中发现，谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、缬氨酸在3种谷物中的含量最高[23]，这与本研究所测食醋样品中丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酸含量最高的结果一致。

根据氨基酸风味特征[24]，将对滋味有贡献的氨基酸分为3类，分别为鲜味、甜味和苦味，将各类氨基酸对照其在水中的呈味阈值，计算出各自的TAV，结果见表4。苦味、甜味和鲜味氨基酸TAV分别为：48.08%～51.65%、28.67%～29.58%和20.25%～21.92%。苦味氨基酸在6个品牌食醋样品中均有滋味贡献，但是食醋中鲜有苦味感，这可能与滋味间的相互作用有关。缬氨酸、组氨酸的TAV为1.72～1.82和2.35～2.49，对醋的苦味有显著的影响；谷氨酸、丙氨酸TAV为2.15～2.31和2.78～2.85，对醋的鲜味和甜味有显著影响。不同的氨基酸呈现出不同的滋味，各种滋味相互协调赋予了食醋独特的口味。方差分析表明，同种氨基酸在不同样品间差异较大，尤其是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、组氨酸等差异极显著。山西老陈醋酿造过程中氨基酸浓度先升高后降低，其浓度变化主要是由于原料中蛋白质降解产生了氨基酸，同时发酵过程微生物的代谢等作用导致氨基酸浓度变化[25]；此外，山西老陈醋熏醅过程中氨基酸会与糖类发生美拉德反应，因此不同厂家采用的熏醅温度以及时间等影响食醋中氨基酸的含量。

表4 山西老陈醋中氨基酸风味强度分析

“-”，P>0.1，差异不显著；“*”，P<0.1，差异显著；“**”，P<0.05，差异极显著。

2.4 山西老陈醋风味轮的绘制

食醋的整体风味主要由气味和滋味组成，即风味物质包括挥发性物质和非挥发性物质。为了将挥发性物质的含量数据转化为感官描述信息，本研究将具有同类香气属性的挥发性物质分为一组，共分为6个香气属性，分别为甜香、烘烤香、坚果香、酸香、花果香和奶香。将每个香气属性中的挥发性物质的ROAV相加，通过雷达图进行表征，即为山西老陈醋的香气轮，见图1(右侧)。香气轮可以较好地将化合物组成与香气特征相联系,可以得到初步的感官描述信息。从图1中可直观看出，6个山西老陈醋样品的香气轮形状相似，山西老陈醋中最主要的2个香气特征是酸性气味和烘烤香，其次为坚果香、甜香和奶香，花果香最低。同时，通过香气轮可以比较不同品牌山西老陈醋的感官特征，如与其他食醋相比，山西老陈醋最独特的香味是烘烤香，这与其独特的熏醅工艺相关。

食醋滋味是判断食醋优劣的重要依据，食醋的滋味主要有酸味、苦味、甜味、咸味和鲜味。由于评价食醋的滋味涉及的因素较多，各滋味感官特性的强度高低不同，且各滋味之间相互影响，本研究不考虑化合物间的相互作用及味感相互融合等因素，从主要呈味化合物及味觉感应角度出发，描述山西老陈醋的滋味感官信息，结合有机酸和氨基酸的含量及对应的味觉阈值，计算各个化合物的味觉强度，并进行整合，绘制山西老陈醋滋味轮，见图1(左侧)。食醋有机酸的味觉强度远高于氨基酸，是醋的主要风味物质。从滋味轮中可明显观察到山西老陈醋中酸味为主体味觉，苦味和甜味次之，并有少许的鲜味。

图1 山西老陈醋风味轮分析Fig.1 Flavor wheel of Shanxi aged vinegar

3 结 论

分别对山西老陈醋中挥发性成分、有机酸、氨基酸等主要风味物质的组成进行了分析，进一步采用风味强度的方法对其风味特征进行了评价。乙酸、苯甲醛、糠醛和2，3-丁二酮和四甲基吡嗪是山西老陈醋中重要的特征风味化合物。从风味轮中可直观观察到山西老陈醋的香气和味觉组成及特征，其中酸味和烘烤香尤其突出。烘烤香是山西老陈醋特有的香气特征，酸味占据主体味觉感受，伴有少许甜味及苦味，且微带有鲜味。山西老陈醋各厂家采用的原辅料、生产工艺大同小异，故该风味轮中6个品牌食醋的差异并不明显，具有较好的代表性。本研究采用风味化学的方法系统评价了食醋的感官风味组成，希望为山西老陈醋生产企业进一步优化发酵工艺，改善产品风味品质提供依据。