茜素绿染料脱色菌株的筛选、鉴定及脱色研究

石 旭，陈栋梁，彭其安

茜素绿染料脱色菌株的筛选、鉴定及脱色研究

石 旭1,2，陈栋梁1,2，彭其安1,2*

（1. 武汉纺织大学 环境工程学院，湖北 武汉 430073；2. 武汉纺织大学 纺织印染清洁生产教育部工程研究中心，湖北 武汉 430200）

从活性污泥中分离到一株茜素绿脱色菌S-3，经16S rRNA基因测序分析，初步鉴定为兼性厌氧型菌弗氏柠檬酸杆菌。研究了该菌株对茜素绿染料的最适脱色条件。结果表明：菌株脱色的最佳培养基配方为胰蛋白胨1.2%、酵母浸粉0.5%、盐浓度0.6%、pH=6.5。采用最优培养基在35℃，静置培养48h后，对茜素绿含量为75mg/L的染液脱色率达92%，且染料废水COD去除率与脱色率成显著正相关关系（＜0.05）。

茜素绿；筛选；鉴定；生物脱色

印染废水中含有大量的原染料，是印染废水中的主要污染物。蒽醌染料具有色泽鲜艳、稳定、耐晒、牢度好等特点，是继偶氮染料之后的第二大类染料。随着偶氮染料禁用范围扩大，蒽醌染料的重要性更加突出[1]。由于蒽醌染料母体骨架蒽醌两边的苯环同时受两个羰基的影响，其结构非常稳定，与偶氮染料相比，处理蒽醌染料废水更加困难。当前，传统的物化处理技术存在着处理成本高、易引起二次污染，在工程应用中受到了一定制约。利用微生物技术处理色度高、难降解的染料废水具有较好的应用前景，因其反应条件温和、成本低廉、不产生二次污染等优势，近年来越来越受学者们的关注[2-3]。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用富集培养基为LB培养基（g·L-1）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，pH7.0。平板分离培养基即LB培养基，加入15 g·L-1琼脂粉。染料培养基即在富集培养基中加入一定浓度的茜素绿染料。活性污泥取自于武汉某印染公司废水处理池，取回后添加一定浓度的染料再次富集培养二个月。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的筛选与鉴定

取1mL污泥上清液加入到100mL茜素绿培养基的三角瓶中（染料浓度50 mg·L-1），30℃培养。每4天更换新鲜的培养液，移取5 mL第一代富集培养液于100 mL新鲜富集培养基中，进行第二代富集，循环富集5代。取菌悬液于固体培养基上分离划线，30℃培养24 h。选取不同形态的单一菌落接种到液体染料培养基中，30℃培养48 h，取上清液离心过滤，测试其脱色效果。将初筛得到脱色效果最佳的菌株接种到装有20 mL 染料培养基的试管中，30 ℃培养48 h，测其脱色率。取复筛后脱色率最高的菌株进行活化传代培养，转接5代，30 ℃培养48 h，测定脱色率，选取最强脱色能力的菌株进行纯化，保存备用。

将筛选出来的菌株送往上海派森诺生物科技有限公司，采用16S rDNA测序技术进行菌株鉴定。用Blast 软件将拼接后的序列文件与 NCBI 16S rDNA数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为菌株初步鉴定结果。

1.2.2 脱色率的计算

取反应后的反应液10 mL，离心（8000 r/min）5 min，上清液过滤后在644 nm下测吸光度，记为At。以不接菌的含相同浓度染料的培养基的吸光度A0为对照，根据公式计算脱色率DE。

1.2.3 脱色优化

（1）培养基优化。筛选出高效脱色菌后，采用正交试验法优化培养基。选取胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、pH为培养基优化因素，正交试验表因素水平安排见表1。

表1 正交试验设计

（2）培养条件优化。在最优培养基条件下，选取溶氧量、温度、染料浓度等影响因素对染料脱色效果的影响，进行单因素实验，优化培养条件。

（3）化学需氧量（COD）的测定。脱色前后的水样送往澳实分析检测（上海）有限公司，采用国标重铬酸钾法测定。

2 结果

2.1 菌株的筛选与鉴定

经分离筛选5株对茜素绿具有较好脱色能力的菌株，分别命名为S-1、S-2、S-3、S-4、S-5。其中，S-3菌株在相同时间内有最高脱色率，转接5代，考察其脱色效果的稳定性，最终脱色效果如表2，分别命名为S-3.1、S-3.2、S-3.3、S-3.4、S-3.5、S-3.6。由表2可知，S-3.1菌株脱色率高，并且脱色效果稳定，因此，在后续实验中选取脱色性能最好的S-3.1菌株作为试验目标菌株。

表2 菌株脱色率

测序得到的序列在 NCBI数据库中比对，选择相似度最大的序列作为菌株初步鉴定结果。普遍研究认为，当16S rDNA序列同源性高于97%时，可以认为是属内的同种[4]。脱色菌与弗氏柠檬酸杆菌的序列相似度为99%，该脱色菌初步鉴定为（弗氏柠檬酸杆菌）。

2.2 脱色优化

2.2.1 培养基优化

培养基是影响菌株生长的重要因素，也直接影响菌株对染料的脱色性能[5]。研究发现，在无外加培养基做碳源的情况下，菌株无法生长，菌株不能以茜素绿为唯一碳源进行代谢，染料的脱色与菌株的代谢相关[3]。在培养基的碳源、氮源不变的情况下，调整其浓度和pH后进行正交试验，结果见表3。

经计算可得，最优培养配方为A3B2C1D1，即胰蛋白胨1.2%，酵母提取物0.5%，NaCl 0.6%，pH=6.5。由极差分析知，该影响菌种脱色效果的次序分别为：胰蛋白胨>NaCl>pH>酵母浸粉。

2.2.2 培养条件优化

（1）溶解氧和温度对染料脱色影响

震荡培养和静置培养对菌株脱色效果具有显著影响（见图1）。在同一温度下，当染料废水含量为50mg/L时，摇床转速为120 r·min-1，菌株脱色能力受到抑制；当温度控制在25-35℃时，从脱色效果来看，该菌株在兼性厌氧条件下脱色效果更佳，说明该菌株为兼性厌氧菌，较充足的供氧反而影响到菌株的新陈代谢[6]。

温度是影响染料脱色效果的关键因素之一[7]。一般认为，适合的温度有助于微生物生长和代谢，但温度过高也会抑制细菌生长，抑制了脱色菌活性，影响脱色效果[8]。本实验在静置培养时，脱色效果随着温度升高而增强，35℃时菌株脱色率高达87%。

表3 培养基正交试验结果

图1 不同培养条件对菌株脱色率影响

图2 染料浓度对菌株脱色率影响

（2）染料浓度对菌株脱色的影响

一般认为，染料浓度越高时，毒性越大，影响脱色酶的活性[9]，脱色率随之下降。本试验菌株对染料废水具有一定的抗逆特性，如图2所示： 35℃条件下，随着染料浓度越高（25-75 mg·L-1），脱色效率越好，当染料浓度达到75 mg·L-1时，菌株的脱色率高达92%。表明该菌对茜素绿染料废水的抗逆特性良好。

（3）染料脱色率与COD去除关系

染料废水中COD去除率是水质处理效果的重要指标之一。本研究中，尽管染料浓度越高，对菌株的毒害作用越强，但COD去除率缺越高，当染料浓度为75 mg·L-1时，COD去除率达到了19.5%（图3）。统计分析结果表明，在三种染料浓度下，菌株对染料废水的脱色率与COD去除率均显著正相关（n=12，=0.647，<0.05）。

脱色时间（h）

3 讨论

利用温和条件下的微生物技术处理染料废水，是水处理技术未来的发展趋势和研究重点[10]。目前，蒽醌类染料脱色细菌为气单胞菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等；蒽醌类染料脱色真菌为青霉属、红酵母属、曲霉属、头孢霉属、栓菌属、地霉属等[11]。研究表明，真菌中的白腐菌分泌的漆酶对底物作用广泛，能降解包括蒽醌染料在内的多种纺织染料，在印染废水处理中具有一定应用前景[12]。有意思的是，纯化后的漆酶对蒽醌染料脱色效果并不如粗酶，说明漆酶需借助其他小分子介质共同脱色，其脱色机理还需更深入研究[13]。本研究筛选出的蒽醌类染料茜素绿脱色菌属于枸橼酸杆菌属()，该菌株不仅对茜素绿染料具有良好的脱色能力效果，还具备一定的降解能力。暗示了枸橼酸杆菌属脱色菌株具有较高的研究价值。

前人的研究表明，微生物脱色效率与营养物浓度、pH、温度、溶氧、染料浓度等因素有关。本试验也考虑了以上因素对茜素绿染料脱色影响，探索出较优的脱色条件，在此条件下，菌株对染料含量高达75 mg·L-1的废水中脱色率达到了92%，经适当驯化后可应用于染料废水脱色工艺中。本研究中，尽管菌株染料废水脱色效果较好（高达92%），但COD的去除率仍有待进一步提高（不到20%），说明该反应体系中仍存在大量难降解的中间体。作者推测，在前期脱色中，受试菌株破坏了茜素绿染料的发光基团，该菌株尚缺乏彻底降解茜素绿染料能力，后期还需结合其他处理技术。

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Screening, Identification and Decolorization on Alizarin Green of a Decolorizing Bacteria

SHI Xu1, 2, CHEN Dong-liang1, 2, PENG Qi-an1,2

(1. College of Environmental Engineering, Wuhan Textile university, Wuhan Hubei 430073 China；2. Engineering Research Center for Clean Production of Textile Dyeing and Printing, Ministry of Education, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430200, China）

A strain of alizarin green decolorization strain S-3 was isolated from activated sludge. According to 16s rRNA gene sequence analysis, the facultative anaerobes strain was identified as. The optimum decolorization conditions for alizarin green were studied. The results showed that the optimum medium for decolorization of the strain was peptone 1.2%, yeast extract 0.5%, salt concentration 0.6% and pH=6.5. The optimum culture medium was used at 35℃ for 48 hours. The decolorization rate of alizarin green dye solution of 75mg/L reached 92%. There was a positive correlation between the COD removal and the dye decolorization rate（<0.05）.

alizarin green; screening; identification; biodecolorization

，彭其安（1981-），男，讲师，博士，研究方向：环境生物技术.

湖北省教育厅科学技术研究项目（B2018061）；武汉纺织大学技术研究院联合开放课题（523010）；武汉纺织大学“环境工程与科学专业主干课程教学团队”项目（201804）；湖北高校省级大学生创新创业训练计划项目（201810495098）.

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