不同预处理对菜蕨孢子萌发的影响

杨曦　苏翠　蒙真铖　陈鸿洁

摘   要   通过对菜蕨孢子的收集时间、贮藏方式、贮藏时间、接种前预处理、消毒灭菌、接种装置等组织培养环节设置对比试验，筛选出有利于提高孢子萌发率的预处理方式。结果表明：菜蕨孢子最佳收集期为7—9月;将收集到的孢子装入离心管后置于4 ℃冰箱中贮藏，贮藏时间不超过1年的孢子都具有较高的活性;以4 ℃冰箱中贮藏3个月的孢子为外植体进行组织培养，用无菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接种于袋装MS培养基中，菜蕨孢子萌发转化为原叶体的数量最多。

关键词    菜蕨;孢子;原叶体;预处理;萌发

中图分类号：Q943.1;S649    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.015

菜蕨[Callipteris esculenta （Retz.） J. Sm. ex Moore et Houlst]为蹄盖蕨科（Athyriaceae）菜蕨属（Callipteris）植物[1]，是滇东南地区深受群众喜爱的食用蕨类之一。菜蕨在该地区食用历史悠久，需求量大，但目前对食用蕨类资源的开发基本停留在采挖野生资源的原始模式，单纯依靠菜蕨自然繁殖，其繁殖率低、生长周期长、种苗获得率低，所得到的种苗不能满足大规模人工种植的需求[2]。近几年，虽然出现郭志友等对菜蕨进行组织培养与植株再生的研究报道，但是在用孢子为外植体进行诱导的过程中还是存在孢子萌发率极低的问题[3]。针对这一问题，本研究以菜蕨的成熟孢子为试验对象，对孢子的贮藏时间、贮藏方式、接种前的预处理、消毒灭菌方式、接种装置等因素开展比较试验，筛选有利于提高孢子萌发率的方式，为加快食用蕨类植物规模化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以成熟的菜蕨孢子或孢子囊为试验材料。

1.2 试验方法

试验时间为2017年12月。

1.2.1 孢子收集、贮藏方式

收集菜蕨孢子时，应选用健壮、有成熟孢子囊群的菜蕨植株羽叶，及时将羽叶孢子或孢子囊刮下，放入50 mL直立离心管中，一种贮藏于4 ℃冰箱中;另一种在常温下贮藏备用。将不同贮藏方式、不同贮藏时间的孢子（见表1），分别取0.02 g装入备好的滤纸袋中编号，作为外植体进行常规消毒灭菌。常规消毒方法：0.1%升汞浸泡8 min→无菌水冲洗3次，接种到聚乙烯袋装MS培养基上，光照强度为1 500 lx，每天光照10～12 h，培养温度为（27±2）℃。重复3次，50 d后统计其成熟的原叶体数量。试验数据用SPSS软件进行统计分析。

1.2.2 接种前预处理

选用在4 ℃冰箱中贮藏3个月、18个月的菜蕨孢子，每个处理分别量取0.02 g，放入准备好的滤纸袋中作为外植体进行浸液处理，具体处理方式见表2，经过常规消毒灭菌后接种于袋装MS培养基上，培养条件及常规消毒方法同上。观察记录每个处理最早萌发出原叶体的时间，并记录萌发情况。

1.2.3 孢子的消毒灭菌

选用在4 ℃冰箱贮藏3个月的菜蕨孢子，分别量取0.02 g放入准备好的滤纸袋中，用无菌水浸泡3 h后，进行消毒灭菌。消毒方法采用组织培养上常用的0.1%升汞溶液浸泡消毒，浸泡时间分别为：3 min、5 min、7 min、10 min、15 min，无菌水冲洗3次后，分别接种到袋装MS培养基中。每个消毒处理接种15袋，重复3次，培养条件同上，15 d后统计不同消毒时间的污染率，50 d后观察孢子萌发情况。

1.2.4 接种方式

随着组织培养技术的发展，近几年在组织培养中多采用成本低廉、密封程度更好、体积小的一次性聚乙烯袋子代替传统玻璃瓶作为分装培养基的载体。试验采用13 cm×14 cm的聚乙烯袋子与传统玻璃瓶作对比，将4 ℃冰箱中贮藏3个月的菜蕨孢子，经4 h无菌水浸液处理、常规消毒灭菌后，分别接种到配方相同的MS袋装培养基和传统玻璃瓶容器MS培养基中，培养条件同上，50 d后观察孢子萌发情况。

2 結果与分析

2.1 贮藏方式及时间对菜蕨孢子萌发的影响

试验结果如图1所示，在4 ℃冰箱中贮藏的菜蕨孢子萌发为成熟原叶体的数量明显高于常温贮藏。贮藏时间在3个月内的菜蕨孢子，随贮藏时间增加，萌发量有一定量的增加，成熟原叶体均值最高可达128个，但贮藏6个月后的孢子整体萌发量下降比较显著，特别是贮藏12个月后的孢子萌发数大幅度下降，常温贮藏1年的菜蕨孢子萌发量极低，贮藏2年以后的孢子基本失活。试验地处于热带季风气候区，试验开展时间为12月，虽然正值冬季，但相对温暖湿润，部分菜蕨配子体还长有极少量成熟孢子囊的羽叶，编号S1与编号S2的采集时间为冬季，孢子质量不佳，编号S3的孢子采集于孢子体羽叶生长旺盛期，成熟孢子囊最多，质量也最好，萌发为成熟原叶体的数量也最多。因此，选择每年7—9月为孢子收集最佳时间，将收集到的孢子置于4 ℃冰箱中贮藏有助于保持孢子活性，能有效提高孢子萌发为原叶体的数量，但贮藏时间不宜过长，贮存期超过24个月的孢子已基本失活。

2.2 消毒灭菌前预处理对菜蕨孢子萌发的影响

试验结果表明，在菜蕨孢子进行消毒灭菌前，将在4 ℃冰箱中贮藏3个月的孢子用无菌水或30 mg·L-1 GA3溶液浸泡4 h，可以提早孢子萌发时间，提高孢子萌发为原叶体的数量，对孢子萌发有较好的促进作用（见表3）。考虑到无菌水的经济成本更低、操作简单、更易获得等优点，选用无菌水浸泡4 h为较佳的预处理方法。将在4 ℃冰箱贮藏18个月的孢子进行相同浸液处理，Y3、Y4与CK2相比，孢子萌发得到的原叶体数也有所提高，特别是Y4处理在提早萌发时间和提高萌发量上效果显著，与翟国燕等[4]研究报道GA3对前一年的孢子萌发有促进作用的结果相一致。

2.3 不同消毒时间对菜蕨孢子萌发的影响

试验结果表明（见表4），延长0.1%升汞消毒灭菌时间，有利于降低污染率，即消毒时间越久，污染率越低;当消毒时间达到15 min时，污染率最低，为2.23%。但消毒时间超过10 min时，孢子萌发为原叶体的数量就大幅度下降;当消毒时间达15 min时，消毒灭菌虽彻底，但对孢子的伤害也最明显，即孢子无污染，也不萌发转化为原叶体，基本失活。综合污染率和萌发转化为原叶体情况来看，菜蕨孢子的适宜消毒灭菌时间为7 min。

2.4 不同接种装置对菜蕨孢子萌发的影响

由图2可以看出，同一份孢子经浸液处理、消毒灭菌后分别接种到袋装MS培养基和传统瓶装MS培养基中，在其配方、培养条件都相同的情况下，袋装培养基中的孢子萌发更快，萌发转化为原叶体的数量要远远高于瓶装培养基。由于袋装培养基密封性更好，能长期保持潮湿的小环境，且培养基表面呈不规则状，与孢子的有效接触面更大，比传统瓶装呈近平面的培养基更有利于菜蕨孢子吸胀及伸出假根，孢子壁开裂长出绿色细胞，再由绿色细胞分裂、分化形成肉眼可见的绿色心形状的原叶体，符合陈维伦[5]等报道孢子在潮湿的环境中先吸胀，生出假根长出绿细胞，再发育转化为绿色心形原叶体的萌发特性相一致。

3 小结与讨论

郭志友等[6]对菜蕨配子体的发育特征进行研究，发现菜蕨孢子易失活与其生长在潮湿的河谷和沙滩等生境有关。要提高菜蕨孢子的萌发率，就要保证孢子尽量不失活。本研究通过对成熟菜蕨孢子的采集时间、贮藏方式、贮藏时间、接种前预处理、消毒灭菌、接种装置等因素开展比较试验，观察记录菜蕨孢子的萌发情况，筛选出适宜的菜蕨孢子贮藏、预处理、消毒、接种方式。生长在温暖湿润热带雨林地区的菜蕨，其孢子生长有明显的季节性，孢子最佳收集期为7—9月;将收集到的孢子装入离心管后置于4 ℃冰箱中贮藏，比常温贮藏更有利于孢子活性的保持，能有效增加孢子萌发转化为原叶体的数量，但贮藏时间不宜过长，不能超过1年;在选用4 ℃冰箱贮藏的孢子为外植体的组织培养过程中，用无菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接种于袋装MS培养基中，是促进菜蕨孢子萌发转化为原叶体的最佳方法，对发展菜蕨规模化生产具有现实意义，但成熟原叶体转化生长为孢子体方面还需进一步研究。

参考文献：

[1] 中國科学院植物志编委会.中国植物志（卷3，第2分册）[M].北京：科学出版社，1999：475-479.

[2] 杨曦，苏翠，孔得信，等.河口地区蕨菜产业发展思考[J].南方农业，2017（5）：40-43.

[3] 郭治友，俞筱押，罗应，等.菜蕨的组织培养与植株再生[J].植物生理学通讯，2010（1）：59-60.

[4] 翟国燕，边珂，贾克功，等.GA3及不同比例MS培养基对蕨菜孢子萌发的影响[J].中国蔬菜，2007（8）：21-23.

[5] 陈维伦，郭东红，石雷，等.蕨类植物的离体种质保存[A].纪念秦仁昌论文集[C].北京：中国林业出版社，1999：412-416.

[6] 郭志友，赵德刚.菜蕨配子体的形态特征研究[J].贵州农业科学，2012，40（10）：29-32.

（责任编辑：易  婧）