不同处理对金银花种子萌发及解剖结构的影响

刘恒++蒋向辉

摘要：采用不同浓度的赤霉素、低温层积、温水浸泡等方法对金银花（Lonicera japonica Thunb.）种子进行处理，并测定其发芽率，同时采用石蜡切片法观察经沙藏处理后的种子解剖结构的变化。结果表明，金银花种子经100 mg/L的赤霉素处理12 h后发芽率最高；金银花种子经20 ℃沙藏40 d后发芽率最高；40 ℃以上温水处理对金银花种子有不同程度的损害，25 ℃清水浸泡对金银花种子发芽有一定的促进作用；在低温层积过程中，金银花种子逐渐完成后熟过程，胚细胞中逐渐积累多糖颗粒，同时随着层积时间的延长，种子薄壁细胞逐渐增大，种皮解体，胚乳中的营养成分逐步分解，提供种子萌发所需要的物质与能量，而高温层积对胚的发育表现出明显的抑制作用。

关键词：金银花（Lonicera japonica Thunb.）种子；萌发；解剖结构

中图分类号：S567.7+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4221-04

金银花（Lonicera japonica Thunb.）又名忍冬，为忍冬科忍冬属（Lonicera）植物，在中国主产于山东、河北、河南、贵州、湖南、四川等省。金银花具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、降血脂、免疫调节等作用，常用于治疗痈肿疔疮、热血毒痢、风热感冒与瘟病发热等症[1]。金银花是很多消炎解毒药的主要原料，中医处方有约三分之一要用到金银花，目前以金银花为原料的中成药已达200多种，而且随着以金银花为主要原料的饮料、保健品和日用化工品的开发，金银花的经济价值更加凸显。

目前，关于金银花的研究主要集中化学成分及药理研究方面[2，3]。金银花种子属于深休眠类型，在自然条件下，需要越冬才能萌发[4]。金银花种子在自然条件下绝大部分将被菌类侵袭、动物捕食与破坏以及其他物理、化学因素破坏，导致其种子质量差、后熟时间长，对其有性生殖过程造成了严重的影响。至今为止，对解除金银花种子休眠方法的研究已有报道[5]，但对其休眠机理、休眠解除机制以及萌发过程中解剖结构变化等方面的研究仍缺乏系统的资料。本研究采用不同的方法对金银花种子进行诱导萌发处理，对有效打破金银花种子休眠的方法进行了探索，同时对种子萌发过程中形态特征及物质消化情况的变化进行了比较研究，以期为深入揭示金银花种子休眠形成的机理和解除休眠的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

金银花种子采自山东省苍山县巨花一号金银花种植基地，种子黑色、长椭圆形，宽度0.16～0.22 cm、长度0.25～0.32 cm，千粒重15.7±0.44 g，含水量6.7%。

1.2 试验方法

1.2.1 回湿处理 在萌发试验前参照郑光华[6]的方法，采用逐级回湿平衡水分法进行回湿处理。

1.2.2 赤霉素处理 50、100、200 mg/L的赤霉素各处理6、12、18 h。以未经任何处理的种子作为对照（CK1），每组50粒种子，记录发芽的种子数。

1.2.3 沙藏处理 10、20、30 ℃各沙藏10、20、30 d。室温（25 ℃）下的种子作为对照（CK2），每组50粒种子，记录发芽的种子数。

1.2.4 温水处理 40、60、80 ℃的水各处理2、4、6 h，并用室温（25 ℃）清水浸泡的种子作为对照（CK3），每组50粒种子，记录发芽的种子数。

1.2.5 发芽率的统计 经不同处理后的种子，置于装有滤纸（保湿）的培养皿中，以胚根长度大于2 mm的统计为萌发，15 d统计结束。发芽率=（发芽种子数/测定种子数）×100%。试验结果采用SPSS 13.0软件进行分析，用t检验分析差异显著性，用Levene Test方法检验数据的方差齐性，用单因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比较（Duncan）方法比较不同数据组间的差异。

1.2.6 石蜡切片 取经不同温度沙藏处理后的金银花种子，除去种皮，用FAA固定液浸渍种子24 h，用自来水洗去固定液，用爱氏苏木精染液进行染色24 h，水洗至不见浮色，加2%氨水处理20 min，再水洗，采用乙醇梯度脱水，用乙醇与二甲苯（1∶1）混合液脱去乙醇。将上述种子浸入纯石蜡中，通过在40 ℃温箱中过夜进行浸蜡，然后进行包埋，干燥2～3 d后进行切片。将黏液涂于洗净的载玻片上，把切好的薄片贴在上面，40 ℃温箱中烤片，用二甲苯进行脱蜡，涂上中性树胶，盖好盖玻片，在10×10倍荧光显微镜下观察并摄影。

2 结果与分析

2.1 不同浓度赤霉素对金银花种子发芽率的影响

赤霉素是广谱型植物生长调节剂，对于种子内含有抑制物质或缺乏内源促进物质的种子有重要的生长调节作用。从图1可知，采用赤霉素处理的金银花种子发芽率有很大的提高，其种子发芽率最高可达44%。100 mg/L与200 mg/L赤霉素处理差异不大，但100 mg/L与50 mg/L的赤霉素处理差异显著，表明最适合金银花种子发芽的赤霉素浓度在100～200 mg/L之间。傅强等[7]研究认为，用赤霉素浸种在一定程度上可以调节种子内的激素平衡，促进生长类激素含量增加，从而打破种子休眠。但是随着赤霉素浓度的升高，处理时间的延长，发芽率也呈现一定的下降趋势，这也说明了高浓度的赤霉素对金银花种子萌发有一定的抑制作用。因此，诱导金银花种子萌发时，赤霉素浓度以采用100 mg/L处理12 h较为合适。

2.2 不同沙藏温度对金银花种子发芽率的影响

低温层积处理是通过构建低温、湿润、通气等条件来解除种子休眠的常用方法。本研究通过金银花种子与湿沙混合，对金银花种子进行不同温度与不同时间的低温层积处理，从图2可知，10 ℃低温短时间层积处理对种子萌发的诱导作用不明显，甚至发芽率比对照还要低，但经低温长时间沙藏处理的种子发芽率比未经沙藏处理的种子发芽率明显要高，尤其在沙藏温度为20 ℃，处理40 d后发芽率最高，表明这一条件下能最有效地解除金银花种子的休眠。随着沙藏温度的升高，金银花种子的发芽率降低，表明高温环境不利于金银花种子的萌发。已有多项研究表明，种子的低温层积可导致种子吸水能力加强、细胞渗透性提高、不溶物转化为可溶物。裴东等[8]研究认为，层积催芽能促使种子合成GA和细胞分裂素等生长激素，降解或转化ABA等抑制激素。本研究结果显示，低温层积与GA的合成与利用之间存在一定的相关性，相关性大小及相关机理有待进一步研究。

2.3 不同水温度对金银花种子发芽率的影响

从图3可知，40 ℃以上的水对金银花种子有不同程度的损害，而且随着时间的延长和水温的升高，损害越来越大，40 ℃水处理6 h以后，种子发芽率在5%以下，水温为60 ℃时，金银花种子活力基本丧失。本研究另外通过对比试验发现，用室温（25 ℃）清水处理的种子发芽率比未经任何处理的要高很多，这可能与清水浸泡能有效增加种子的含水量有关，种子含水量增加能有效促进种子的生理代谢，缩短休眠时间，从而提高发芽率。

2.4 不同沙藏处理对金银花种子胚解剖结构的影响

由图4可以看出，金银花种子种皮较厚，由3～4层细胞构成，胚乳发达，胚较小。金银花种子在10 ℃沙藏处理前期，胚乳细胞与外层薄壁细胞排列紧密，随着低温处理时间的延长，胚乳细胞与薄壁细胞出现膨大、变形、细胞间分界不清的现象，淀粉粒分布散乱，细胞变形破裂，表明胚的萌动能力逐渐增强。在20 ℃沙藏处理前期，胚的淀粉粒均为单粒卵圆形，分布均匀，体积大小基本一致。随着处理时间的延长，淀粉粒形态分化较大，分布散乱，胚内部细胞染色明显增强，内部结构分化明显，苏木精染液是生物活性染色剂，染色效果的增强表明沙藏增强了金银花种子内部组织活性，结果表明，金银花种子具有一定的生理后熟作用，需在低温湿润条件下贮存一段时间后才能顺利萌发。从图4还可以看出，20 ℃沙藏40 d后的种子与其他处理的种子相比，胚分化明显提前，能有效加剧金银花种子淀粉粒的消耗和提高胚的活力。30 ℃沙藏处理20 d后胚根能正常分化，40 d后胚根逐步形成，但30 ℃沙藏60 d后胚根逐步失去活性，生长停止。从图4中还可以看到，近胚根端的胚乳细胞的细胞壁先降解，而近子叶端的胚乳细胞中细胞壁降解相对滞后，由此可以判断近胚根端的胚乳细胞比近子叶端的胚乳细胞的生命活动更加旺盛。

3 小结与讨论

3.1 影响金银花种子活力及细胞完整性的因素

植物种子的活力与种子细胞结构的完整性紧密相关，种子在采收、贮藏与催芽过程中，如造成细胞膜的损伤、细胞器的畸变等都将导致种子活力的变化[9]。本试验发现金银花种子的种皮细胞外有层厚厚的脂质层，而脂质层的疏水特性决定种子不易受到水分影响而难于吸水萌发。随着水温升高，能加快脂质层的溶解，种皮向外形成突起，导到种皮与胚之间出现空隙，这些都可以提高种胚的活力，促进种子的萌发。但随着水温的进一步升高，导致种子含水量下降、胚轴内部细胞出现变形及结构发生破坏、淀粉粒破裂，加剧了种子内部维管束组织和薄壁细胞活性的丧失，对外部细胞及种皮也产生不良的影响，赵鹏等[10，11]研究认为，这种不良影响主要表现为种子相对电导率的上升，正是由于种子内部细胞活性的丧失和结构完整性的破坏导致了种子活力的下降。

3.2 淀粉粒活性和数量的变化对金银花种子活力的影响

淀粉粒作为细胞主要能量和碳架贮藏库，其数量、形态的变化和活性的丧失，能够反映植物生长发育的能量变化情况[12]。程红焱等[13]研究发现，淀粉粒数量的减少、淀粉粒的变形破裂以及活性的丧失加速了种子细胞的老化劣变，影响种子活力。本试验研究表明湿水处理和沙藏处理中，随贮藏温度的升高，金银花种子细胞内的淀粉粒数量减少、活性逐渐丧失，萌发种子的胚根长变短，尤其在50 ℃水处理和30 ℃沙藏后处理后，种子细胞内淀粉粒数量显著减少，萌发试验中不具萌发力的种子增多且出现腐烂现象，能够萌发的种子其萌发后胚根缩短，且伴随有胚根腐烂的现象，这些都源于种子内部细胞活性的丧失及结构的损伤。金银花种子在20 ℃以下低温沙藏处理时，种子发芽率和能量保持能力强，有效地保持种子细胞活性及结构完整性，并且在此温度下，淀粉粒数量随温度升高而呈上升的趋势。因此，10 ℃或20 ℃沙藏处理能有效促进金银花种子的萌发，而以20 ℃沙藏处理40 d效果最好。

3.3 胚乳细胞中的脂质小泡的变化对金银花种子萌发的影响

从图4可以看出，金银花种子胚乳中充满着脂质小泡。这些脂质小泡作为金银花种子胚乳中的主要贮藏物质，在整个层积过程逐步地分解以提供种子萌发生长所需要的营养物质，而通常种子中的主要储藏物质是淀粉，是通过淀粉的分解来提供养分。从图4E可以看出，金银花种子在层积了40 d后，胚乳细胞中的脂质小泡逐渐降解，液泡开始形成，图中的黑色粒状结构可能是脂粒或蛋白质，由于脂粒或蛋白质染色较深，显微镜下呈黑色，这个时期蛋白质形成是种子萌发生长的明显标志。金银花种子层积60 d后，淀粉进一步地分解，由大颗粒分解为小颗粒，脂粒也出现分解的现象，这主要是由于种子的生理活动需要更多的养分供应，要求胚乳中的营养物质不断地分解为容易运输和吸收的小分子的物质，正是胚乳细胞地脂质小泡的解体，提供了种子进一步代谢活动所需要的营养。

植物种子萌发时，一般是胚根的分生细胞先分裂、伸长，在土壤中形成根，然后下胚轴伸长，将胚芽推出地面，长成幼苗[14]，金银花种子的萌发过程与此基本一致，在这处过程中，低温层积条件对金银花种子萌发有至关重要的意义，层积开始时细胞质膜逐渐分解、脂质小泡分解形成液泡、大的淀粉颗粒逐步分解为小的个体等，这些都表明在低温层积过程中金银花胚乳中营养物质不断地分解以提供种子萌发生长所必需的养分。因此，研究胚乳内含物的变化情况可以弄清金银花种子萌发的进程，从而找到有效打破金银花种子休眠的方法。

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