氧化石墨烯修饰三维氧化锆骨组织工程支架的制备及细胞相容性研究

魏小翠，穆 睿，毕 博，韩璧瑶，于泓川，陈 博，王 玥，史小蕾，臧圣奇，金 磊

作者单位：210002南京，南方医科大学南京临床医学院（东部战区总医院）口腔科[魏小翠（医学硕士研究生）、穆 睿、毕 博、韩璧瑶、于泓川、陈 博、王 玥、史小蕾、臧圣奇、金 磊]

0 引 言

应用于颌面部大面积骨缺损修复的组织工程支架除需具有良好的生物相容性外，还需要优异的机械性能来承担应力并支撑组织再生。本课题组前期成功制备出机械强度高，孔隙率大小合适的三维联通纳米氧化锆（Zirconia，ZrO2）支架用于骨组织工程，经体内外实验证实其具有良好的成骨能力［1-3］。但ZrO2是惰性陶瓷材料，与细胞及组织亲和性欠佳。氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）作为石墨烯的氧化衍生物，因其优异的理化性能以及良好的生物活性在组织工程领域引起广泛关注［4-8］。其表面丰富的含氧基团可提供活跃的结合位点，易于与特定的生物分子，蛋白及药物相互作用，从而进一步功能化［9-10］。因此，采用GO修饰ZrO2支架有望进一步改善其机械性能及生物活性。

在骨缺损修复研究中，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是主要的种子细胞来源，并且代表了骨修复的金标准。然而BMMSCs取材时骨髓抽取过程痛苦，大样本培养时获得的有核细胞数量有限，并且容易随着代数递增其增殖和分化能力降低，以上缺点限制了BMMSCs的应用［11-12］。人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是来源于牙齿的间充质干细胞，可以从脱落的乳牙或因治疗需要拔除的离体牙中取材，不会为患者增加额外痛苦。并且已有研究证实hDPSCs具有成骨分化能力，一定诱导条件下可以形成具有Havers系统和血管组织的成熟骨组织样结构［13-14］。这些优势使hDPSCs成为合适的骨组织工程种子细胞来源。本研究将GO均匀结合于三维ZrO2支架表面，检测复合支架压缩强度的变化，并与hDPSCs共培养，进一步研究复合支架的体外细胞相容性，从而综合评估其在颌面部骨缺损修复中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与细胞 天然石墨粉（美国Bay Carbon）；硅烷耦联剂（GLYMO）（美国Sigma Aldrich）；TRITC标记的鬼笔环肽工作液（1：500）（德国Millipore）；细胞活力检测试剂（MTS）（美国Promega）。hDPSCs为本实验室从离体牙中分离提取、保存的细胞株。本研究经过医院伦理会批准（批准号：2017NZGKJ-048），患者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器 扫描电子显微镜（SEM）及X光微区分析（EDS）（日本Tanaka）；透射电子显微镜（TEM，日本JEM-200CX）；傅里叶红外光谱仪（FTIR，美国NICOLET）。

1.3 方法

1.3.1 GO的合成 采用改良Hummers法合成GO。用电子天平精确称量1 g天然石墨粉，加入25 mL浓硫酸，冰浴中混合。缓慢加入3.5 g高锰酸钾，冰浴中搅拌＞2 h。加热至35℃后继续搅拌反应1 h，加入80 mL去离子水，缓慢搅拌并加热至98℃反应15 min，采用100 mL去离子水进一步稀释反应液，并滴入双氧水至无气泡冒出。混合液用稀盐酸及去离子水充分离心洗涤，真空冷冻干燥12 h。

1.3.2 GO的表征 将少量GO粉末分散于无水乙醇中，滴于铜柱上，60℃下干燥，表面喷金后置于电镜托盘上，SEM下观察GO表面形貌；将少量GO粉末分散于无水乙醇中，负载于铜网上，进行TEM测试；将GO粉末采用KBr压片法制样，进行FTIR测试，扫描范围为（500～4000）/cm。

1.3.3 GO修饰三维ZrO2支架的制备 制备三维ZrO2支架进行以下复合实验［1］。40℃下将ZrO2支架浸入3%GLYMO/乙醇溶液中静置30 min，轻吹，120℃下烘烤。分别称取5、1、1.5 mg的GO粉末分散于10 mL去离子水中，超声震荡3 h，制得均匀分散的0.5、1、1.5 mg/mL的GO分散液。将硅烷化后的ZrO2支架分别浸入3种浓度的GO分散液中反应1 h，得到3组复合支架，分别为0.5、1、1.5 mg/mL GOZrO2，40℃下烘干备用。扫描电镜下观察单纯的ZrO2支架与上述3个浓度GO修饰的ZrO2支架，后期选择ZrO2支架与最适宜浓度GO结合的复合支架（GO-ZrO2）进行下一步实验。

1.3.4 复合支架的机械性能检测 制备0.5 cm×1.0 cm×1.5 cm的GO-ZrO2及ZrO22种支架用于压缩强度测试，将万能试验机的机头加载速度设为0.5 mm/min，记录压缩强度。

1.3.5 复合支架细胞相容性测试 将GO-ZrO2及ZrO22种支架与hDPSCs共培养，采用静态表面接种法接种细胞。在接种之前，将支架浸入完全培养基中，置于37℃的CO2培养箱内孵育24 h。移去培养基，取生长状态良好的第3代hDPSCs，调整细胞密度为每100 μL细胞悬液中含有1×106个细胞，逐滴加入到2种支架中，于37℃，5%CO2的恒温培养箱中孵化4 h，继续培养，隔天换液。细胞培养1、3、5 d时，将复合细胞的支架用37℃预热的PBS溶液轻柔地漂洗3次，4%多聚甲醛室温固定10 min，0.5%Triton X-100溶液透化处理5 min，加入TRITC标记的鬼笔环肽工作液（1∶500）至没过支架表面，室温避光孵育染色1 h。加入1 μg/mL的DAPI染色液避光孵育5 min，倒置荧光显微镜下观察细胞在支架上的黏附形态。

按上述方法接种细胞，细胞培养1、3、5 d后，MTS法检测细胞增殖情况。具体方法为：将支架取出置于干净的培养孔，每孔分别加入100 μL培养基，20 μL的MTS溶液，避免产生气泡，放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中静置孵化1 h，吸取反应后悬液各100 μL置于96孔板中，490 nm波长下测A值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，定量资料以均值±标准差（xˉ±s）表示，组间比较采用t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GO的制备和表征 真空冷冻干燥后的GO样品呈浅棕色片状，经超声震荡后可均匀分散于去离子水中，并在静置超过1周后，仍未见明显沉淀。SEM下观察，GO呈片状，可见褶皱的表面形貌，部分GO片层在边缘折叠翘起；透射电镜下可清晰地观察到GO呈轻纱状半透明微皱的片状结构，高分辨过滤像中可见该区域的晶体结构显示出与石墨一样的六元环结构，见图1。GO的FTIR结果显示，GO中在3400/cm处出现代表-OH的强吸收振动峰，除此之外，在1000/cm～1750/cm，还出现环氧基、羰基、羧基的吸收峰，见图2。

2.2 GO-ZrO2支架的合成 不同浓度的GO与硅烷化处理后的ZrO2支架复合后，肉眼可见，复合支架的颜色随着GO浓度的增高而逐渐加深；支架的三维网状联通结构没有明显改变，未出现明显的堵孔现象。见图3。扫描电镜观察可见，单纯ZrO2支架在低倍电镜下可见相互联通的网状结构，支架骨架表面仍可见细小的裂纹，0.5 mg/mLGO-ZrO2支架未见到明显的GO片层。高倍电镜下1.0 mg/mLGO-ZrO2支架可见到薄层的GO沉积在支架骨架的裂纹处，连接裂纹两端，并且可观察到陶瓷颗粒表面沉积带有褶皱的层状GO。1.5 mg/mLGO-ZrO2复合支架陶瓷颗粒的表面见大量多层GO团聚堆叠。见图4。因此选择ZrO2支架与1 mg/mL GO结合的复合支架（GO-ZrO2）进行下一步实验。

图1 镜下观察氧化石墨烯形态Figure 1SEM and TEM images of GO

图2 氧化石墨烯傅里叶红外光谱图Figure 2FTIR spectra of GO

2.3 GO-ZrO2支架的机械性能 机械性能对比结果显示，GO-ZrO2支架的压缩强度为［（1.292±0.087）Mpa］较ZrO2支架［（1.031±0.076）Mpa］显著增加（P＜0.05）。

2.4 复合支架细胞相容性GO-ZrO2及ZrO2支架上进行细胞培养1、3、5 d后，荧光显微镜下观察细胞骨架，可见细胞有效的黏附于2种支架表面，并可进入支架内部，分布均匀。与单纯ZrO2支架相比，在GO-ZrO2支架上均可见细胞更为密集的伸展黏附于支架表面，表现出更为活跃的细胞增殖状态。见图5。2种支架上细胞活力检测结果进一步证实，hDPSCs在GO-ZrO2支架上培养1、3、5 d时，细胞活力均显著高于单纯ZrO2支架（P＜0.05），见图6。

图3 4组支架的光学电子图Figure 3 Optical pictures of four groups of scaffold

图4 不同倍数扫描电镜下观察支架表面形貌Figure 4 SEM images at different magnifications of four groups of scaffolds

图5 荧光显微镜下观察hDPSCs在支架上的细胞形态Figure 5 Fluorescence microscope images of hDPSCs cultured on ZrO2and GO-ZrO2scaffolds for 1，3，5 days

图6 hDPSCs在单纯ZrO2支架和GO-ZrO2支架上培养5天的增殖情况Figure 6 Cell proliferation of hDPSCs cultured on theZrO2and GO-ZrO2scaffolds for 5 days

3 讨 论

理想的骨组织工程支架材料除需要具有一定的机械强度来维持组织形态外，还需具有良好的生物活性来促进细胞长入和组织整合。本研究采用GO修饰三维ZrO2支架，从而改善复合支架的机械性能并增加支架表面与细胞的亲和力；首先采用改良Hummers法制备GO，经扫描电镜及透射电镜观察，证实GO为纳米薄片状。其表面及边缘呈现出起伏的褶皱结构，这是由于较小的薄片允许官能团在边缘形成氢键，为了减少体系的自由能，使片层变形［15］。GO的晶格结构为均匀分散的六元环状，这说明在化学处理后，GO仍保留着与石墨一致的完整的晶格结构。FTIR证实了GO含有丰富的含氧基团，其中羰基的存在表明制备过程中发生了强烈的氧化反应。据文献报道，在生物材料应用中，小粒径及氧化程度高的GO可提高其生物相容性［16］。

为了在ZrO2表面涂覆均匀的GO，需要摸索合适的复合时间和复合浓度，如果提高浓度就必须要延长复合时间，如果延长复合时间就需要降低浓度。根据文献查询和不同预实验的结果，本研究选择0.5、1、1.5 mg/mL3种浓度梯度的GO与ZrO2支架反应1 h，形貌观察结果显示，0.5 mg/mLGO-ZrO2支架表面复合GO较少，存在大面积未复合区域。1.5 mg/mLGO-ZrO2支架可见GO片层在支架表面团聚堆叠，明显的改变了其原有纳米形貌。而1 mg/mLGOZrO2支架可见到GO均匀涂覆在支架表面，并在裂纹处形成桥接，连接裂纹两端。综上所述，在1h的反应时间下，1.0 mg/mL GO与硅烷处理后的ZrO2支架结合可达到最佳复合效果。复合支架机械性能测试结果显示，GO复合后，GO-ZrO2支架的压缩强度较单纯ZrO2支架显著增加。机械强度的增高得益于GO有效的结合在复合支架的表面，GO薄片的褶皱纹理可增强基体的机械连锁和荷载转移；除此之外，GO片层在支架表面原有的微裂纹处沉积，连接裂纹两端，在压缩强度测试的外力施加过程中，GO形成的裂纹桥接可阻止裂纹的延伸，从而使复合材料的强度增加［17-18］。

hDPSCs可在GO-ZrO2支架上有效黏附，并均匀分布生长，呈现出活跃的增殖状态。这一方面由于GO-ZrO2支架表面具有丰富的含氧基团，使其亲水性增加，而亲水性的表面有利于细胞早期黏附［19-20］。GO粗糙微褶的纳米表面也可增强细胞骨架的张力，提供更强的黏附力［21］。这些因素均有利于防止细胞在GO-ZrO2支架上接种过程中脱落，可提高细胞接种率，进而有利于后期增殖。另一方面也有研究提出，GO可以保护间充质干细胞免受活性氧对细胞的损害和细胞凋亡，从而提高细胞的增殖能力［22-23］。

综上所述，GO修饰三维ZrO2支架后可显著提高压缩强度并有利于hDPSCs早期增殖，在颌面部骨缺损修复中展现了良好的应用前景。