RNA干扰沉默水通道蛋白3基因对人肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响

付雪岩，王雅玮，王文青，吴刚

（中国医科大学附属第一医院 1.普通外科；2.老年外科，沈阳 110001）

水通道蛋白3（aquaporin3，AQP3）属于水通道蛋白家族（aquaporins，AQPs），是一种位于细胞膜上的蛋白质，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水、甘油和其他一些小溶质分子在细胞内外的进出［1］。目前，AQP3被认为与癌症的发生发展密切相关［2］。在肝癌中，相对于癌旁组织，AQP3在肝癌组织中表达明显升高并且与肝癌的分级、分期、转移和预后有关［3-5］。本研究中通过干扰沉默人肝癌细胞SMMC-7721的AQP3基因的表达，检测其对细胞增殖和细胞凋亡的影响，初步探讨AQP3与肝癌发生发展的关系，可能为肝癌的诊断和治疗提供一个新的靶点和方向。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

肝癌细胞株SMMC-7721购于中国科学院（中国上海）。DMEM培养基中加入10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和100 U/mL青霉素和链霉素（美国Hyclone公司）。在37 ℃下、5% CO2的加湿培养箱中培养细胞。

1.2 细胞转染

将SMMC-7721细胞接种在6孔板中，并培养直至达60%融合。去除6孔板中含有的血清，采用Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）分别转染siRNA-NC、siRNA-AQP3#1和siRNA-AQP3#2（苏州吉玛制药技术有限公司），继续培养48 h后进行相关研究。将细胞分为4组：空白对照组、siRNA-NC组、siRNA-AQP3#1组和 siRNA-AQP3#2组。siRNA-AQP3#1和siRNA-AQP3#2序列如下：siRNA-AQP3#1 F，5'-CC UUUGCCAUGUGCUUCCUTT-3'；R，5'-AGGAAGCA CAUGGCAAAGGTT-3'。siRNA-AQP3#2 F，5'-CCCU UAUCGUGUGUGUGCUTT-3'；R，5'-AGCACACACA CGAUAAGGGTT-3'。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

参照Trizol说明书提取SMMC-7721总RNA。然后使 用GoScriptTMReverse Transcription Mix，Random Primers试剂盒（美国Promega公司）反转录成cDNA。最后在ABI PRISMR 7500（美国ABI公司）PCR仪上进行荧光实时定量PCR，cDNA扩增使用GoTaqR qPCR Master Mix（美国Promega公司），采用两步法标准PCR扩增程序：第1步（预变性）95 ℃ 2 min 1个循环；第2步（PCR反应）95 ℃ 15 s，60℃，共40个循环。根据CT值通过公式2-ΔΔCt进行相对定量分析计算得AQP3mRNA相对表达量。AQP3的引物及内参β-actin［10］由生工生物工程（中国上海）公司合成。AQP3F，5'-CCGTGACCTTTGCCATGTG-3'；R，5'-CGAAGTGCC AGATTGCATCATAA-3'。β-actinF，5'-CGTCATAC TCCTGCTTGCTG-3'；R，5'-GTACGCCAACACAGTG CTG-3'。

1.4 细胞增殖实验

取对数生长期的细胞，胰酶消化并收集4组细胞，1 000 r/min离心，去上清，加入完全培养基，调整细胞浓度到5×103/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，每孔设4个复孔，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂（中国碧云天公司），继续在培养箱孵育1.5 h，在酶标仪上选择450 nm波长测定每孔的吸光度值，描绘生长曲线。对于平板克隆实验，将细胞以1 500/孔接种在6孔板上2周。然后，用磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞2次，4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色，最后计数菌落数。

1.5 细胞凋亡检测

按照凋亡试剂盒（日本Dojindo Labotories公司）说明书操作，胰酶消化并收集4组细胞，PBS洗涤2次，并收集约5×105细胞，1 000 r/min离心5 min 后加入100 μL Annexin V缓冲液悬浮细胞，最后分别加入PI和Annexin-V染液吹打混匀，室温避光染色15 min加入400 μL Annexin V缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 Western blotting

足量的4组细胞常规消化离心，在冰上裂解，将得到的裂解物离心，取上清，并用BCA法测定浓度，样品均定量为5 μg/μL，变性，取50 μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳，70 V 80 min转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭90 min。孵育一抗（1∶1 000），4 ℃过夜孵育。次日，TBST洗膜后室温孵育二抗2 h（1∶10 000），TBST清洗，最后在ECL仪上完成发光。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件分析，数据用±s表示，2组间比较采用t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干扰沉默后AQP3表达水平的检测

采用RNA干扰技术沉默AQP3基因，实时PCR及Western blotting 分析处理后的4组细胞的AQP3mRNA及蛋白的表达水平。结果显示，siRNA-AQP3#1组（0.276 9±0.047 78）和siRNA-AQP3#2组（0.462 9±0.084 02）的AQP3mRNA和蛋白质的表达明显下调（图1），且差异有统计学意义（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。说明AQP3 siRNA转染可以有效的干扰沉默AQP3mRNA和蛋白的表达。

2.2 CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖

图1 干扰后AQP3 mRNA和蛋白表达水平Fig.1 AQP3 mRNA and protein expression levels after interference

使用CCK-8方法对4组细胞转染后24 h、48 h、72 h的活力进行观察，发现siRNA-AQP3#1组（59.00±4.583）和siRNA-AQP3#2组（68.33±7.024）均表现出明显的活力降低，说明细胞增殖能力减弱。平板克隆集落形成实验也得到相似的的结果（图2），且差异有统计学意义（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

图2 各组处理因素对细胞增殖能力的影响Fig.2 Effect of the treatment factors on the cell proliferation ability of each group

AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示，siRNA-AQP3#1组（10.6±0.413 1）和siRNA-AQP3#2组（8.22±0.353 0）的凋亡比率明显高于其余2组（图3），且差异有统计学意义（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。说明沉默AQP3能够明显促进SMMC-7721细胞的凋亡。

图3 各组处理因素对细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of the treatment factors on apoptosis in each group

3 讨论

肝细胞癌是世界上第五大常见的癌症，并且也是癌症相关死亡的第二大原因，大多数患者在疾病的晚期被诊断出来，失去手术治疗机会，且预后较差［6-7］。过去几十年，人们一直致力于肝癌的分子机制研究，而随着医学分子技术的发展，众多关于肝癌发生发展的关键分子被发现及研究，对于肝癌的诊断及治疗有着重大的意义。

AQPs是一类内在膜蛋白通道，其促进水和小分子（如甘油）通过由渗透或溶质梯度驱动的细胞膜扩散。在哺乳动物中表达的13种同种型（AQP0～12）对水稳态和能量平衡起着至关重要的作用［8-9］。AQP3基因位于人染色体9p13.3，其在多种上皮细胞的基底外侧质膜中表达。在胃肠道中，AQP3在胃黏膜组织、回肠和远端结肠中表达，有助于水和甘油的转运。在呼吸道中，AQP3在上呼吸道和下呼吸道中表达，能够促进穿过气道上皮细胞的渗透水的运输。此外，AQP3在脑、乳腺、肝脏、胰腺、卵巢、前列腺和膀胱等上皮细胞中都有表达［2］。近些年来，随着先进的分子技术对AQPs研究的深入，越来越多的研究证据表明，AQP3在癌症的进展和转移中起着关键作用。除了膀胱癌，AQP3在大多数癌症中都呈高表达，具体的作用机制尚不清楚，可能通过影响细胞增殖、迁移、上皮间质转化过程以及潜在的下游调控元件参与癌症的发生发展。例如，在胰腺癌中，AQP3通过调节mTOR信号传导促进胰腺癌的增殖生长［10］；在胃癌中，AQP3参与细胞的增殖、迁移和侵袭过程，并且可能通过调节PI3K/AKT/SNAIL信号通路参与胃癌细胞的上皮间质转化过程［11］；在乳腺癌中，AQP3通过调节H2O2转运及其下游细胞信号传导控制乳腺癌细胞的迁移过程［12］。

本研究采用RNA干扰技术沉默人肝癌细胞SMMC-7721的AQP3表达，沉默后的mRNA和蛋白水平明显下降，说明AQP3 siRNA起到了很好的干扰效果。此外，沉默AQP3引起的SMMC-7721细胞增殖能力减弱，细胞凋亡增加，但其具体作用机制尚不清楚。随着对AQP3在肿瘤发生发展过程中作用机制的深入研究，相信AQP3未来将作为肝癌生物治疗的新靶点，在肝癌的早期诊断、早期治疗中发挥更为重要的作用。