CDKN2A/2B基因单核苷酸多态性与妊娠期糖尿病的相关性▲

刘 念 于祥远 秦林原 张 军 余红平,3

(1 桂林医学院公共卫生学流行病学教研室，广西桂林市 541004，电子邮箱：498106735@ qq.com；2 上海交通大学附属新华医院妇产科，上海市 200092；3 广西医科大学附属肿瘤医院肿瘤科，南宁市 530021)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是最常见的妊娠并发症之一，其在我国的发病率为6.8%～10.4%[1-2]。GDM可导致孕妇妊娠期间发生流产、早产、妊娠期高血压、羊水过多、糖尿病酮症酸中毒等情况，并增加产后发生2型糖尿病及其他慢性疾病的风险，也可导致巨大胎儿、胎儿生长受限、胎儿畸形、新生儿窒息等[3]。研究表明，GDM是由环境、遗传因素、生活方式等多种因素导致的复杂性疾病，但有关遗传方面的病因机制尚未完全清楚[4]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基因组最常见的遗传变异，被广泛用于疾病风险预测和预后评估等。全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)显示，胰岛素样生长因子2结合蛋白2基因、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN)2A/2B基因等的SNP与GDM显著相关[5]。CDKN2A/2B可抑制周期蛋白依赖性激酶4/6的活性，从而导致胰岛B细胞的增殖能力受损，引起拮抗胰岛素样物质的增加，进而导致GDM的发生[6]。此外，CDKN2A/2B基因rs10757261和rs2383208位点的SNP还可调控胰岛B细胞的分泌功能，从而影响GDM的发生[5，7]。但是，目前有关CDKN2A/2B基因SNP与GDM发生的关系仍未完全明确。因此，本研究探讨CDKN2A/2B基因的遗传多态性与GDM的关系，以期为GDM早期诊断和防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年9月至2016年6月在桂林医学院附属医院和桂林市妇女儿童医院于孕24～28周行定期产检的孕妇1 030例。所有研究对象均行OGTT。排除标准：既往患有糖尿病、高血压、肝肾功能不全者；有其他妊娠合并症者；近期服用影响糖代谢药物者。根据国际妊娠合并糖尿病研究组织制定的GDM诊断标准[8]，1 030例孕妇中， GDM患者459例(病例组)，正常妊娠者571例(对照组)。本研究经桂林医学院和桂林市妇女儿童医院伦理学委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 收集资料：收集所有研究对象入组时的临床资料，包括年龄、身高、体重、收缩压、舒张压、空腹血糖、OGTT后1 h血糖、OGTT后2 h血糖、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)。

1.2.2 全血基因组DNA提取：采集研究对象空腹外周血2 mL，按照血液基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司，生产批号：281525AX)的操作要求提取外周血DNA；应用NanoDrop3000核酸测定仪(美国Thermo Scientific公司)检测DNA浓度和纯度，A260/A280比值在1.7～1.9为符合DNA纯度要求；将符合纯度要求的DNA标本置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 选择候选基因SNP位点：利用美国国立卫生研究院环境卫生科学研究所数据库(http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm)、美国国立生物技术信息中心SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和国际人类基因组单体型图数据库(http://www.hapmap.org)等生物信息学工具，并基于GWAS与GDM相关的研究[9-10]，选择CDKN2A/2B基因的SNP位点，所有SNP位点在中国北京汉族人群中最小等位基因频率≥5%。应用美国国立卫生研究院环境卫生科学研究所SNP Function Prediction工具选择转录因子结合位点、转录后剪切位点、微小RNA结合位点等区域的SNP位点，经连锁不平衡TAG SNP Selection工具检测，各位点需满足连锁不平衡系数r2<0.8。计算机检索美国国立生物技术信息中心SNP数据库，选择与GDM、血糖水平、胰岛B细胞功能等显著关联的SNP位点，结合有关GWAS的研究报道[9-10]，选择与GDM遗传易感性存在显著关联(P≤1×10-7)的位点。最终筛选出CDKN2A基因rs2811710、rs3088440、rs7036656位点，CDKN2B基因rs1063192、rs3217986、rs3217992位点和CDKN2A/2B基因rs10811661位点。

1.2.4 候选SNP位点基因型检测：利用Sequenom MassARRAY SNP分型系统(北京博奥生物科技有限公司)对候选SNP位点进行基因型检测。(1)PCR扩增反应。按照反应体系加入反应成分，包括10 ng/μL DNA 1 μL、10×缓冲液0.5 μL、25 mmol/L氯化镁0.4 μL、5 U/μL Taq 0.2 μL、25 mmol/L脱氧核苷三磷酸0.1 μL、20 μmol/L特异扩增引物混合液1 μL，去离子水补足至4 μL。(2)反应程序。94℃预变性15 min；94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循环45次；最后72℃终末延伸3 min。(3)质谱检测。应用Sequenom MassARRAY系统制备检测SpectroChip芯片，对PCR产物进行虾碱性磷酸酶纯化、单碱基延伸反应、树脂纯化处理后，采用MALDI-TOF质谱仪(北京博奥生物科技有限公司)分析，最后采用TYPER 4.0软件获取原始数据及基因分型图。基因分型的检测由北京博奥生物科技有限公司完成。

1.3 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。应用拟合优度χ2检验分析候选SNP位点在对照组中的基因型分布频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验。应用多因素非条件Logistic回归模型，分析各SNP位点基因型与GDM发生风险的关系，其中，分析各基因型之间及显性模型(GA/AA、TC/CC、AG/GG或GT/GG)与隐性纯合子(GG、TT、AA或TT)之间GDM发生风险的差异，并经年龄、体质指数、收缩压、舒张压等因素较正后，分析各SNP位点基因型与GDM发生风险的关系。采用多因子降维法(分析软件为mdr_3.0.2)分析多位点与GDM发生的交互作用。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组孕妇的临床资料比较 病例组孕妇年龄、体质指数、空腹血糖、OGTT后1 h血糖、OGTT后2 h血糖、HbA1c、收缩压、舒张压水平均高于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组孕妇的临床资料比较(x±s)

2.2 候选基因SNP位点与GDM易感性的关系 CDKN2A基因rs3088440、rs7036656位点，CDKN2B基因rs1063192、rs3217986位点和CDKN2A/2B基因rs10811661位点基因型在对照组中的分布频率差异无统计学意义(均P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，见表2；而CDKN2A基因rs2811710位点和CDKN2B基因rs3217992位点基因型在对照组中的分布频率差异有统计学意义(χ2=14.503,P<0.001；χ2=9.091，P=0.003)，不符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，因此未进一步分析其与GDM发病风险的关系。

多因素分析结果显示，与携带CDKN2A/2B基因rs10811661位点CC基因型比较，携带TC或TT基因型孕妇的GDM患病风险均升高；在显性遗传模型下，与CC基因型携带者相比，携带TC/TT基因型的孕妇发生GDM的风险升高(均P<0.05)。经年龄、体质指数、收缩压、舒张压等因素校正后，结果显示，各候选基因SNP位点基因型与GDM发病均无关联(均P>0.05)。见表2。

表2 候选SNP基因型与GDM易感性的关系[n(%)]

注：a为拟合优度χ2检验结果；b为未校正的分析结果；c为校正了年龄、体质指数、收缩压、舒张压的分析结果。

2.3 候选SNP位点间的交互作用 结果显示，最优单位点模型为rs10811661位点(P<0.05)；SNP-SNP联合作用与GDM发生存在关联，rs10811661-rs7036656-rs1063192-rs3217986位点的交互作用可增加GDM发生风险(P<0.05)，交叉验证一致性为10/10，测试平衡准确性为0.4850。见表3。

表3 候选SNP位点间交互作用分析

注：其他单位点模型及交互作用分析中P>0.05，故未列出相应结果。

3 讨 论

CDKN2A/2B基因是染色体9p21上两个邻近的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制基因。CDKN2A和CDKN2B分别编码细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a和p15INK4b，可抑制细胞周期蛋白激酶4/6的活性，从而抑制胰岛B细胞的增殖能力[6]。动物研究结果显示，缺乏细胞周期蛋白激酶4的小鼠由于B细胞增殖能力下降以及胰岛组织减少而罹患糖尿病，而细胞周期蛋白激酶4过表达的小鼠则出现B细胞的病理增殖[3]；也有学者发现在小鼠体内高表达的p15INK4b与胰岛发育和胰岛素分泌不全有关[11]。另外，CDKN2A/2B基因的rs10757261和rs2383208位点多态性可调控胰岛B细胞的分泌功能，进而引起GDM的发生[5,7,9]。由此可见，CDKN2A/2B基因参与了胰岛B细胞增殖的抑制以及功能的损伤等多个过程，从而导致GDM的发生。

本研究结果显示，CDKN2A/2B基因rs10811661位点多态性与GDM易感性存在关联， TC和TT基因型携带者发生GDM的风险分别是CC基因型携带者的1.416倍和1.478倍，在遗传模型中，携带TC/TT基因型者发生GDM的风险是携带CC基因型者的1.441倍(均P<0.05)；但经年龄、体质指数、收缩压、舒张压等因素校正后，各候选基因SNP位点基因型与GDM发病均无关联(均P>0.05)。目前，关于CDKN2A/2B基因rs10811661位点多态性与GDM遗传易感性关系的研究结果不尽相同。一项韩国的GWAS研究显示，CDKN2A/2B基因rs10811661位点多态性与GDM的发病显著相关[5]；一项病例对照研究也证实，rs10811661位点多态性与GDM的发病存在相关性[12-15]。但也研究结果显示，CDKN2A/2B基因rs10811661位点多态性与GDM遗传易感性无关[16-18]。一项Meta分析结果表明，携带rs10811661位点T等位基因的孕妇发生GDM的风险升高，而在亚洲人群和高加索人群中T等位基因携带者较多[19]。据此，我们推测遗传背景的不同，导致不同地区或种族间的妊娠期女性对GDM的易感性存在明显的群体差异，因此在不同人群中同一位点的关联研究结果会存在差异。

多因子降维法是一种非参数、无需考虑遗传模式的高阶交互作用分析方法，适用于多基因或与环境因素共同决定的慢性疾病的分析，如糖尿病、原发性高血压、心房颤动等[20-21]。SNP是微小遗传因素，可能难以检测到单个效应，而多因子降维法可识别多种SNP之间的交互作用，可以提高分析联合作用对个体GDM易感性影响的效能。GDM是多基因遗传病，因此本研究采用多因子降维法分析候选SNP位点的交互作用。结果显示，最优单位点模型为rs10811661位点；rs10811661-rs7036656-rs1063192-rs3217986位点的交互作用与GDM发病存在关联(均P<0.05)。上述结果提示这些位点可能共同构成了GDM发生的多基因异常机制。

综上所述，CDKN2A/2B基因rs10811661位点多态性与GDM发生相关，CDKN2A/2B基因SNP位点的单独或联合作用均可影响妊娠期女性对GDM的易感性。本研究也存在一些不足：环境因素在GDM的发病过程中起着重要作用，但本研究未能对吸烟、膳食、运动等其他环境因素进行控制，可能影响结果分析。今后可进一步纳入家族史、不良生育史、生活方式等因素，并在不同人群、不同地区、大样本中进行验证，也可探索SNP与胰岛B细胞功能性指标的关系，在功能性实验的支持下深入探讨关联关系和发病机制。