大果卫矛和欧洲卫矛叶片呈色机制研究

宋 鹏，丁彦芬，李 涵，王亚楠

(南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210000)

色叶植物是园林植物的重要组成部分。随着园林绿化事业的迅速发展，人们对园林植物的色彩要求越来越高，传统的色叶植物已经不能满足人们的需求，因此，加强色叶植物的开发意义重大。卫矛属植物是我国大部分地区都有分布的乡土树种，萌发力强，秋季叶色艳丽，对不利环境具有较强的抗性，是一类具有很高观赏价值的园林绿化树种[1]。但目前仅有卫矛(Euonymusalatus)、丝棉木(E.maackii)、扶芳藤(E.fortunei)、胶州卫矛(E.kiautschovicus)和冬青卫矛(E.japonicus)等[2-3]植物在园林绿地中有所应用，该属大部分植物还处于野生状态。

大果卫矛(E.myrianthus)是我国特有的植物，根系发达，耐修剪，叶色常绿，可用作整形植株材料。欧洲卫矛(E.europaea)原产欧洲，抗性较强，秋叶鲜红，是一种值得推广的优良观叶植物，可用来制作绿篱。以往对该属植物的研究主要集中在繁殖技术[4]上，有关该属植物叶片结构和转色期叶片生理变化的研究较少，鉴于此，以常绿植物大果卫矛和落叶植物欧洲卫矛为材料，观测两者叶片的形态结构，并对转色期叶片的生理指标进行对比，综合分析植物叶片的呈色机制，以期为提高该属植物的观赏价值和色叶植物的开发应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点和材料

试验地点为江苏省句容市乾景园林苗木有限公司基地(北纬32°05′，东经118°49′)，位于长江中下游平原，属亚热带季风气候，年平均气温15.2 ℃，无霜期229 d，年降雨量1 058.8 mm。材料为生长健康、长势一致的大果卫矛和欧洲卫矛3年生实生苗。

1.2 方法

1.2.1 叶片的采集 从2018年10月下旬欧洲卫矛叶色变化开始，选取生长健康、长势一致、无明显病虫害的植株15株，每5株为一重复，重复3次。每8 d采一次样，直至12月初全部叶落。每次采样在10：00进行。选取树冠向阳面中上部叶位相同、大小一致、健康成熟的叶片。按此法在相同时间采取大果卫矛的叶片。采后用冰盒带回实验室，洗净干燥，剪去中脉，称量完毕后置于-80 ℃冰箱保存待测。此外，选取完全变红的欧洲卫矛和常绿的大果卫矛叶片，剪取若干 0.5 cm×0.5 cm的小块，经 2.5%戊二醛液(北京中镜科仪技术有限公司，分析纯)固定带回实验室。

1.2.2 指标测定和方法 戊二醛液固定的叶片经乙醇(南京化学试剂股份有限公司，分析纯)逐级脱水、临界点干燥仪(EMITECH-K850，英国Quorum公司)干燥、离子溅射仪(HITACH E-1010，日本松中实业有限公司)真空喷镀金膜，使用环境扫描电镜(FEI Quanta200,荷兰FEI公司)观察叶片表皮和切面并拍照。

光合色素含量的测定参照张宪政[5]的方法；花色素苷相对含量的测定采用盐酸甲醇浸提法，以每克鲜质量在10 mL提取液中变化1个OD值为1个花色素苷单位；可溶性糖和淀粉含量的测定采用蒽酮比色法[6]；苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查尔酮异构酶(CHI)活性的测定参照姜琳[7]的方法；过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的测定参照卓启苗等[8]的方法，以每克鲜质量在相应波长下变化0.01个OD值为1个酶活性单位。所有指标的测定均为3次重复，取平均值。

1.3 数据分析

采用Excel 2007 和 SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，并使用 Excel 2007作图，折线图中的值以平均值±标准差表示，采用Photoshop对电镜图进行处理。

2 结果与分析

2.1 2种植物叶片形态结构

由图1可知，两者的表皮形态特征相似，表皮细胞相互之间排列紧密，未发现有明显变异的细胞，也未发现皮毛之类的附属物。两者的气孔均位于下表皮，上表皮未发现气孔。这样的分布特点符合陆生植物的气孔分布，既避免了干旱胁迫下水分的散失，又保证了植物光合作用的进行[9]。2种植物叶片横切面形态结构基本相同，均是典型的异面叶，叶片组织结构从上往下，依次为上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮。上表皮为单层细胞，排列紧密，细胞呈规则的方形。栅栏组织由数层规则的长柱形薄壁细胞组成，其长轴与叶片表皮垂直，相邻细胞之间排列紧密。靠近下表皮的是海绵组织，海绵组织细胞的大小和形状不规则。下表皮也由单层细胞构成，排列紧密。2种植物的栅栏组织细胞和上表皮之间排列紧密规整，未发现气室。

A、B、C分别为大果卫矛叶片的上表皮、下表皮和横切面；D、E、F分别为欧洲卫矛叶片的上表皮、下表皮和横切面；S：气孔；U：上表皮；PT：栅栏组织；ST：海绵组织；L：下表皮A,B,and C are the upper epidermis,lower epidermis,and cross-section of the leaves of E.myrianthus respectively；D,E,and F are the upper epidermis,lower epidermis,and cross-section of the leaves of E.europaea respectively； S：Stomata； U：Upper epidermis；PT：Palisade tissue；ST：Spongy tissue；L：Lower epidermis图1 大果卫矛和欧洲卫矛叶片扫描电镜照片(比例尺=200 μm)Fig.1 The scanning electron micrograph of the leaves of E.myrianthus and E.europaea(Bar=200 μm)

2.2 2种植物叶片光合色素含量和花色素苷相对含量变化

高等植物光合作用过程中吸收光能的色素统称为光合色素，主要有叶绿素和类胡萝卜素，其中叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b[10]。大果卫矛和欧洲卫矛的光合色素含量随时间推移均呈下降趋势，但不同色素下降幅度不一样。12月3日大果卫矛的叶绿素含量比10月24日下降47%，叶绿素a含量的下降趋势与叶绿素含量的下降趋势高度一致，而叶绿素b含量下降幅度较小，据此可认为叶绿素含量的下降主要是因为叶绿素a的分解，大果卫矛花色素苷相对含量在整个时期变化不大(图2A)。欧洲卫矛叶绿素含量12月3日比10月24日下降82%，类胡萝卜素含量下降76%，下降的幅度明显高于大果卫矛，说明欧洲卫矛作为落叶植物，其光合色素比常绿植物更容易分解。欧洲卫矛的花色素苷相对含量在前期上升幅度较小，但后期呈明显上升趋势，且高于大果卫矛的花色素苷相对含量(图2B)。

A.大果卫矛; B.欧洲卫矛 A.E.myrianthus; B.E.europaea图2 2种植物叶片光合色素含量和花色素苷相对含量变化Fig.2 The changes of photosynthetic pigment content and anthocyanin relative content in leaves of two Euonymus species

2.3 2种植物叶片色素含量占比变化

由于花色素苷相对含量的单位(U/g)与光合色素的单位(mg/g) 不同，故将花色素苷相对含量缩小10倍，再计算各类色素在色素总量中的占比，绘制成百分比含量堆积柱形图(图3)。在整个时期大果卫矛的叶绿素含量占比显著高于花色素苷和类胡萝卜素含量，因而叶片一直呈现绿色(图3A)。欧洲卫矛的叶绿素含量占比由最初的65%下降到16%，类胡萝卜素含量占比由12%下降到2%，花色素苷含量占比由最初的24%上升到83%，花色素苷含量占比升高是叶片由绿转红的主要原因(图3B)。

A.大果卫矛; B.欧洲卫矛 A.E.myrianthus; B.E.europaea图3 2种植物叶片色素含量占比变化Fig.3 The changes of proportion of various pigments in leaves of two Euonymus species

2.4 2种植物叶片可溶性糖和淀粉含量变化

如图4所示，大果卫矛和欧洲卫矛叶片可溶性糖含量变化趋势不一致。大果卫矛的可溶性糖含量变化不大，在70 mg/g左右。欧洲卫矛的可溶性糖含量呈先上升后下降的单峰曲线，在11月1日达到峰值(97 mg/g)，且大部分时期都高于大果卫矛的可溶性糖含量，结合两者叶色变化情况，初步推测可溶性糖含量可能与叶色有一定联系(图4A)。两者淀粉含量变化没有呈现出一定规律(图4B)，这表明淀粉含量可能与叶色变化没有关系，但大果卫矛可能通过分解淀粉以获取更多的能量来保持叶色常绿。

图4 2种植物叶片可溶性糖和淀粉含量变化Fig.4 The changes of soluble sugar and starch contents in leaves of two Euonymus species

2.5 2种植物叶片花色素苷相关酶活性变化

如图5A和B所示，大果卫矛叶片的PAL和CHI活性保持平稳；欧洲卫矛叶片的PAL活性变化没有呈现一定规律，CHI活性呈现先上升后下降的单峰曲线，峰值在11月9日出现，为346 U/g。欧洲卫矛的PAL和CHI活性显著高于大果卫矛，表明这2种酶对花色素苷的合成可能有促进作用。大果卫矛叶片的POD和PPO活性在整个时期呈下降趋势，但总体变化不大(图5C、D)。欧洲卫矛的POD活性呈下降趋势，到后期已经没有活性，PPO活性在前期有所升高，后期下降。大果卫矛POD和PPO活性高于欧洲卫矛，表明这2种酶可能会抑制花色素苷的合成。

图5 2种植物叶片花色素苷相关酶活性变化Fig.5 The changes of anthocyanin-related enzyme activities of leaves of two Euonymus species

2.6 2种植物各生理指标间的相关性分析

由表1可知，大果卫矛叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量呈显著正相关，说明秋冬季常绿植物叶片的光合色素会同时发生分解。淀粉含量与POD活性呈显著正相关，与PPO活性呈极显著正相关。CHI活性与淀粉含量呈极显著负相关，与POD活性呈显著负相关。

由表2可知，欧洲卫矛叶片的叶绿素与类胡萝卜素含量和POD活性呈极显著正相关。CHI活性与POD和PPO活性呈显著正相关。

表1 大果卫矛叶片各生理指标之间的相关性Tab.1 Correlation coefficients between indexes of E.myrianthus

注：*和**分别表示相关系数达到0.05和0.01的显著水平，下同。

Note:* and **denote that correlation coefficients are significant at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same below.

表2 欧洲卫矛叶片各生理指标之间的相关性Tab.2 Correlation coefficients between indexes of E.europaea

续表2 欧洲卫矛叶片各生理指标之间的相关性Tab.2(Continued) Correlation coefficients between indexes of E.europaea

3 结论与讨论

植物叶片的表皮细胞和栅栏组织细胞形状、排列以及气室分布会影响叶片的呈色[10]，这些因叶片结构发生变化而使叶色发生变化的植物被称为结构类彩叶。狗枣猕猴桃的白色叶片的栅栏组织中比正常绿叶存在更多的气室[11]，使叶色看上去发白。金鱼草花色的深浅是由花冠裂片表皮是否有圆锥状突起的细胞决定的[12]。本试验结果表明，通过扫描电镜观察，大果卫矛和欧洲卫矛的叶片均是异面叶，叶片表皮不存在圆锥形细胞，相邻栅栏组织细胞排列紧密，不存在气室，可以认定这2种植物叶片的结构对其呈色没有影响。结合前人的研究，可推测结构类彩叶主要存在于阴生植物中，这类植物的叶肉组织中没有明显的栅栏组织和海绵组织的分化，细胞之间存在气室，入射光在叶肉细胞气室间会形成漫反射[10]，从而使肉眼看到的叶色发生改变。

植物叶色主要是由叶片细胞中色素的种类、分布、含量以及各类色素含量的比例决定的[13]。植物叶片细胞的色素主要有4类，分别是叶绿素、类胡萝卜素、花色素苷和甜菜色素。叶绿素合成的最低温度为2～4 ℃，早春低温限制了叶绿素的合成，秋冬季的低温又加速了叶绿素的分解，这两段时间花色素苷与类胡萝卜素含量较多，所以植物的叶片呈现出非绿色。花色素苷可以调控叶片对光能的吸收，减少强光对叶片的破坏。甜菜色素主要分布于火龙果、雁来红和紫茉莉等石竹目的10个科的植物中[14]。本试验发现，大果卫矛叶片的叶绿素虽然分解了一部分，但在叶片中仍占据绝对优势，所以叶片仍为绿色，而欧洲卫矛的叶片在初期叶绿素占比较高，叶片呈现绿色，但随着花色素苷的不断合成、叶绿素和类胡萝卜素的不断分解，花色素苷占比不断升高，叶色从绿转红。

研究表明，可溶性糖的积累有助于花色素苷的合成[15-16]。对元宝枫叶片喷施质量分数4%的蔗糖溶液可以提高其观赏性[17]。4种槭属植物叶片的可溶性糖含量在转色期表现为先上升后下降的单峰曲线[18]，本试验结果与之有些类似，大果卫矛的可溶性糖含量总体变化不大，欧洲卫矛的可溶性糖含量呈先上升后下降的单峰曲线，对比两者发现，可溶性糖参与了花色素苷的合成，但是可溶性糖与花色素苷的合成并不是简单的线性关系，因为可溶性糖不仅为花色素苷的合成提供能源，同时也为其他色素合成提供底物和能源，能在一定范围内影响着色，但并不是决定性因素[19]。淀粉是叶片光合作用产物，主要为植物代谢提供能量，由相关性分析可知，淀粉与花色素苷的合成无显著关系。

PAL和CHI参与花色素苷的合成，POD和PPO参与花色素苷的降解[20]。本试验中，大果卫矛和欧洲卫矛叶片PAL和CHI活性与花色素苷相对含量呈不显著相关，这表明PAL和CHI并不是花色素苷合成的关键酶。此外，大果卫矛POD和PPO活性高于欧洲卫矛，这表明POD和PPO在一定程度上会抑制花色素苷的合成[21]。花色素苷是黄酮类化合物，具有清除自由基的功能[22]，与POD在植物体内共同起抗氧化的作用，两者可能存在某种互补关系[23]。

综上所述，大果卫矛和欧洲卫矛叶色的变化主要是因为叶片色素含量的比例发生了变化，与叶片结构没有关系。可溶性糖促进花色素苷的合成，POD和PPO抑制花色素苷的合成。在实际环境中可以通过对叶片喷施糖溶液和提高相关酶活性来提高观赏价值。但要更深一步地揭示植物呈色机制，可以探究植物叶片色素的合成途径[24]，也可以探索外界环境对叶片呈色的影响[25]以及叶片细胞的超微结构在转色期的变化[26]。