健康学龄前儿童入幼儿园前后鼻咽部病原学变化的队列研究

罗春绸 蔡惠贞 张月葵 蔡梦云 林秀梅 刘玲红 严 琳 谢丽琴

急性上呼吸道感染(AURTIs)是儿童最常见的疾病，支原体、病毒和细菌等病原体均可致病，由于病原体可通过飞沫传播，因此环境因素与AURTIs密切相关[1]。Nesti等[2]通过回顾分析Medline、Lilacs和Cochrane图书馆数据库中的相关文献后发现，在日托或学前教育中照料的儿童发生感染疾病的风险是居家儿童的2～3倍。集体生活增加了感染性疾病风险。本研究对首次入托的健康学龄前儿童采集咽拭子标本行病原体检测，并随访学期期间AURTIs发生时或学期结束时病原学情况，旨在为疾病预防、规范诊疗提供参考依据。

1 方法

1.1 研究设计 以福建省漳州市一个公立幼儿园为队列研究现场，以首次入托的学龄前儿童为研究对象，以入幼儿园生活作为暴露因素，于入托前体检时、入托48 h后第1次发生AURTIs时、1个学期结束时(未发生AURTIs的学龄前儿童)，咽拭子采集鼻咽部分泌物，行病原学检测和细菌药敏试验，考察入幼儿园生活对鼻咽部病原学的影响。

1.2 伦理和知情同意 研究方案获得福建医科大学附属漳州市医院(我院)伦理委员会批准(2017-LW-20)。本研究对入托儿童及其家长告知如下：①1个学期期间用咽拭子采集鼻咽部分泌物2次；②学期期间第1次因AURTIs未上幼儿园者，幼儿园老师立即与课题负责人联系，或根据病情指导家长到我院儿科呼吸科就诊或去患儿家行咽拭子采集鼻咽部分泌物；③免费行鼻咽部分泌物的病原学检测及细菌药敏试验。监护人了解研究过程和要求，并签署知情同意书。

1.3 AURTIs诊断标准 AURTIs是鼻腔、咽或喉部急性炎症的总称。①普通感冒以鼻咽部卡他症状为主；②急性咽炎的主要症状为咽部干燥、灼热感、咽痛等；③急性扁桃体炎的症状主要为咽痛、发热、吞咽困难等。AURTIs可伴有不同程度的全身症状，如肌肉疼痛、头痛、发冷、出汗和疲乏等[3]。反复呼吸道感染(RRTI)是指 0～14 岁儿童在1年中患上呼吸道感染> 5次，或患下呼吸道感染 >2次。

1.4 样本量计算 根据公式 N=(Zα+Zβ)2×4P(1-P)/(P1-P2)2计算样本量[4]。规定α=0.05，β=0.1，公式中单侧Zβ=1.28，单侧Zα=1.65，P1=0.10(正常咽部病原体携带率2%～15%)，P2=0.40(AURTIs发作时病原体检出率20%～70%)，P=(P1+P2)/2，入托后整学期儿童AURTIs发生率按75%估计，计算样本量约96例。考虑中途有研究对象退出队列观察，增加10%样本量，计划入组105例。

1.5 纳入标准 ①2017年8月4日至2018年1月10日学期、符合福建省漳州市幼儿园入园条件、首次入托、3～4岁的健康儿童；②入园前1周内无发热、流涕、咽痛、咳嗽等呼吸道感染症状；③入园前1周内未使用抗感染药物；④无消化不良、佝偻病、原发性免疫缺陷病等[1]。

1.6 咽拭子采集方法 由5年以上工作经验的儿科护士采集标本，采集标本前予生理盐水清洁儿童口腔，压舌板轻压舌后立即用无菌拭子左右2次擦拭咽后壁分泌物后取出，放入标本采集管中立即送检。

1.7 病原学检测方法 咽拭子标本分别接种于血琼脂培养皿及巧克力培养皿，置于5%CO2培养箱35℃培养18～24 h，观察细菌生长；细菌数量鉴定≥2+者行药敏试验。采用荧光标记的呼吸道病毒单克隆抗体分别检测呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒(ADV)，流感病毒A型(Iva)、B型(Ivb)，副流感病毒Ⅰ型(PIV Ⅰ)、Ⅱ型(PIV Ⅱ)和Ⅲ型(PIV Ⅲ)的抗原，操作过程参照试剂说明书。采用PCR-荧光探针法进行肺炎支原体、衣原体核酸DNA定量检测(试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司产品)，按试剂盒说明书分步操作。

1.8 统计学分析 SPSS 13.0软件进行统计学分析，计数资料采用卡方检验或Fisher精确概率法，检验水准a=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文纳入标准的学龄前儿童119例，男58例。学期中1例退园，学期末对未发生AURTIs的学龄前儿童行咽拭子采样时，再次询问入托期间有无AURTIs，3例儿童家长承认有AURTIs，但未告知幼儿园老师，115例学龄前儿童纳入本文分析。入托时均行咽拭子采集并行病原学检测，年龄最小 2岁11月，最大3岁10月，平均 3.4岁。91例(79.1%)在学期期间发生AURTIs，均在第1次AURTIs行咽拭子采集并行病原学检测；24例在学期期间未发生AURTIs，均在学期末行咽拭子采集并行病原学检测。

2.2 第1次AURTIs临床表现 最短入托后15 d发生AURTIs，最长119 d，<4周内19例，～8周9例，～12 周31例，～16周27例，～19周5例。学期中发生第2～6次AURTIs分别为63(54.8%)、29(25.2%)、16(13.9%)、6(5.2%)、2(1.7%)例。表1显示，第1次上呼吸道感染以扁桃体肿大、扁桃体脓点、鼻塞流涕、发热、咽痛、咽充血、咳嗽、头痛、肌肉酸痛、腹泻为主要症状和体征。进展至下呼吸道感染12例，败血症1例。1个学期中上呼吸道感染 5次以上占6.9%(8/115)，下呼吸道感染 2次以上占2.6%(3/115),总体RRTI发生率9.6%(11/115)。学期期间3例发生2次下呼吸道感染，1例诊断气管炎(第1次AURTIs支原体阳性)，1例诊断肺炎(第1次AURTIs支原体阳性和金黄色葡萄球菌3+)，1例诊断肺炎(第1次AURTIs金黄色葡萄球菌2+)。

表1 第1次上呼吸道感染病例临床表现和病原学检测[n(%)]

2.3 入托时病原学检出情况 表2显示，①培养出细菌114例，共9种细菌，最多1例培养出5种细菌，培养出细菌400种次，平均每例(3.3±0.8)种。②检出支原体阳性1例(1.1%)，均未检出衣原体、RSV、ADV、Iva、Ivb、PIV Ⅰ、PIV Ⅱ、PIV Ⅲ和混合感染。

2.4 第1次AURTIs病原学表现 表2显示，①培养出12种细菌，最多1例培养出5种细菌，培养出细菌298种次，平均每例(3.3±0.6)种。第1次AURTIs较入托时奈瑟菌属(88.7%vs78.0%)、肺炎链球菌(22.6%vs20.9%)感染率减少，流感嗜血杆菌(11.3%vs17.8%)、乙型溶血性链球菌(0vs8.8%)感染率增加，差异均有统计学意义；肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌和化脓性链球菌细菌数量鉴定≥3+的例数有所增加。②检出支原体和病毒24例(26.4%)，其中支原体14例，Iva 5例，PIV Ⅰ、Ivb、ADV各2例，未培养出衣原体、RSV、PIV Ⅱ和PIV Ⅲ。③细菌+病毒11例，包括奈瑟菌属+Ivb、+PIV Ⅰ各 1例，草绿色链球菌+ Iva 4例、+PIV Ⅰ 1例，+ADV 1例，流感嗜血杆菌+Ivb 1例，凝固酶阴性葡萄球菌+ADV1例，奈瑟菌属+肺炎链球菌+Iva 1例。支原体+细菌13例，包括支原体+奈瑟菌属5例，+草绿色链球菌4例，+肺炎链球菌、+金黄色葡萄球菌、+凝固酶阴性葡萄球菌各1例，+草绿色链球菌+奈瑟菌1例。

2.5 学期中未发生AURTIs的学龄前儿童病原学表现 表2显示，共培养出9种细菌，最多1例培养出4种细菌，最少1例培养出3种细菌，培养出细菌87种次，平均每例(3.6±0.5)种；学期结束时较入托时仅化脓性链球菌细菌数量鉴定≥3+增加了1例，均未检出支原体、衣原体、RSV、ADV、Iva、Ivb、PIV Ⅰ、PIV Ⅱ、PIV Ⅲ。

表2 咽拭子标本细菌和真菌培养情况[n(%)]

注U1和P1为第1次AURTIs儿童与首次检测儿童比较，U2和P2为未发生AURTIs儿童与首次检测儿童比较

3 讨论

本研究以幼儿园为队列研究现场，以首次入托的健康学龄前儿童为研究对象，通过幼儿园集体生活的暴露，观察入托前体检时、入托48 h后第1次AURTIs时、1个学期结束时(未发生AURTIs的学龄前儿童)鼻咽部分泌物病原学的动态变化。1学期中仅1例因退园退出队列观察，3例儿童家长在学期末承认学期中有过AURTIs，但未告知幼儿园老师，不进入队列数据分析；96.6%(115/119)的学龄前入托健康儿童完成队列观察。

进入队列的115例学龄前健康儿童入托时用咽拭子采集鼻咽部分泌物；学期中第1次因AURTIs未上幼儿园，即得到了儿科呼吸科专业诊疗帮助并行咽拭子采集鼻咽部分泌物；真实地反映了学龄前健康儿童入托时和入托后第1次AURTIs的病原学的变化。

学期中RRTI发生率9.6%(11/115)，低于中华医学会儿科学分会呼吸学组在RRTI的临床概念和处理原则中RRTI的发生率20%，可能与样本统计人群不同有关。

本研究115例学龄前儿童入托时咽拭子标本培养，平均每例培养出细菌(3.3±0.8)种。91例学期中第1次AURTIs的学龄前儿童，平均每例培养出细菌(3.3±0.6)种，每例平均细菌种次一致。Unger等[5]发现，呼吸道定植菌可以引起呼吸道感染，也可以仅仅是正常呼吸道定植菌，单次咽拭子病原体检测无法准确判断AURTIs病因。115例学龄前健康儿童入托时和24例在学期期间未发生AURTIs儿童的定植菌包括奈瑟菌属(88.7%vs83.3%)、草绿色链球菌(71.3%vs79.2%)、微球菌(42.6%vs66.7%)、革兰阳性杆菌(36.5%vs58.3%)、凝固酶阴性葡萄球菌(45.2%vs8.3%)、肺炎链球菌(22.6%vs16.7%)、流感嗜血杆菌(11.3%vs33.3%)、金黄色葡萄球菌(7.8%vs12.5%)、阴沟肠杆菌(0.9%vs0)和化脓性链球菌(0vs4.2%)，除金黄色葡萄球菌外，其他定值菌检出率差异均无统计学意义。

本研究表明，第1次AURTIs时流感嗜血杆菌、乙型溶血性链球菌感染比例增加，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、乙型溶血性链球菌、化脓性链球菌和大肠埃希菌细菌数量鉴定≥3+的例数有所增加。与中国儿童细菌耐2017年儿童细菌感染以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌最为常见[6]一致。

本研究91例学期中发生AURTIs的学龄前儿童，入托时咽拭子标本仅检出支原体阳性1例(1.10%)，Cai等[7]检测汕头大学医学院附属第二医院1980例急性呼吸道感染儿童鼻咽抽吸标本，1 087例检测出至少1种以上病毒，而对照健康受试者鼻咽分泌物未检测到任何病毒。本研究第1次AURTIs时检出支原体和病毒25例(27.5%)，其中支原体14例，Iva5例，PIV Ⅰ、Ivb、ADV各2例，未培养出衣原体、RSV、PIV Ⅱ和PIV Ⅲ。Dong等[8]及Wang等[9]分别对上海市及深圳市AURT儿童采集鼻咽拭子进行呼吸道病毒检测，阳性率分别为24.5%及14.55%，常见感染病毒为IFV、PIV、RSV、ADV等。

急性呼吸道感染儿童呼吸道分泌物中常常同时检测到致病病毒和细菌，因此呼吸道感染常见于细菌和病毒混合感染[10]。中国台湾的研究[11]对416例急性咽炎儿童进行咽拭子病毒和细菌培养，11.1%患儿中发现病毒与细菌混合感染。本研究中，91例学期中发生AURTIs的学龄前儿童，26.4%(24/91)检测出两种以上病原体，其中细菌+病毒11例，细菌+支原体13例。AURTIs时细菌检出数量与入托时基本一致，仅在不同细菌比例上存在变化，尚无法说明为混合感染因素致病。