黑豆抗氧化肽的酶解条件优化及分级制备

田 地，任 健

(1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2.黑龙江省玉米主食工业化工程技术研究中心， 黑龙江 齐齐哈尔 161006； 3.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

黑豆主要产于中国、日本、韩国、美国等国家。由于黑豆具有耐旱、耐瘠、适应性广、营养价值高等特点，在我国的大部分地区都有栽培，以东北产量最多[1]。研究表明[2]，黑豆蛋白质含量比黄豆高24.5%，相当于鸡蛋的3.38倍。黑豆蛋白的氨基酸组成与动物蛋白相似，含有18种氨基酸，必需氨基酸占氨基酸总量的40%以上，符合FAO/WTO均衡模式标准[3]，能满足人类强体益智的需求。

超滤是一种新型生物分离技术，具有操作简单、易于放大等优点，目前已被广泛应用于蛋白质和多肽的分离[4-6]。作为一种膜分离方法，通过压力差的推动可选择性地将溶液中较大溶质分子截留于微孔滤膜上[7]。将超滤技术应用于蛋白肽的分离纯化，有利于提高肽的生理活性。田少君等[8]发现相对分子质量小于3 kDa的小分子大豆肽具有较高的自由基清除率。张宇昊等[9]发现经超滤分离后，相对分子质量小于1 kDa的花生短肽降血压活性很强。周丽珍等[10]采用先超滤后纳滤联用工艺制备的花生短肽液具有较强的ACE抑制活性和体外抗氧化活性。

本试验以黑豆分离蛋白为原料，利用Alcalase对其进行酶解，得到制备抗氧化肽的最佳酶解条件，随后利用超滤法对所得酶解产物进行分离，探究不同相对分子质量组分的抗氧化性，为扩大黑豆分离蛋白在食品工业中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

黑豆，购于黑龙江省齐齐哈尔市；Alcalase(酶活力≥20万U/g)，上海宝曼生物科技有限公司；水杨酸，分析纯，天津市科密欧化学制剂有限公司；DPPH，分析纯，上海生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

ZNCL-GS智能磁力搅拌器；TU-1810型紫外可见光分光光度计；PB-10型酸度计；323E型膜过滤系统，瑞典。

1.2 试验方法

1.2.1 Alcalase酶解黑豆分离蛋白

参照王小庆等[11]的方法提取黑豆分离蛋白。以黑豆分离蛋白为底物配制一定质量分数的蛋白分散液，放入磁力搅拌器中水浴至试验所需的温度，调节pH至9.5，加入Alcalase并搅拌。反应过程中以1 mol/L NaOH维持pH恒定。酶解至预定时间后，将酶解液置沸水浴中灭酶10 min，冷却后于4 000 r/min条件下离心15 min，所得上清液即为黑豆分离蛋白酶解液。

1.2.2 超滤法分离黑豆分离蛋白酶解产物

黑豆分离蛋白酶解液依次采用10、5 kDa和3 kDa截留相对分子质量的超滤膜进行超滤，得到大于10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa及小于3 kDa的组分，测定各组分的抗氧化性。

1.2.3 水解度(DH)的测定

采用pH-stat法测定酶解产物的水解度[12]。

1.2.4 抗氧化性测定

(1)羟基自由基(·OH)清除率：参照Fenton反应方法建立反应体系模型[13]。取2 mL 2 mg/mL黑豆分离蛋白酶解产物，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁、2 mL6 mmol/L的双氧水，混匀后静置10 min，加入2 mL6 mmol/L的水杨酸，振荡混匀，静置30 min，在510 nm处测定吸光值，记为Ai，用去离子水替代水杨酸测定的吸光值记为Aj，空白对照组以去离子水代替样品，测定的吸光值记为A0。按下式计算·OH清除率(K)。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(2)DPPH自由基清除率：参照Zhang等[14]的方法测定。取2 mL 2 mg/mL黑豆分离蛋白酶解产物，加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，混匀，避光反应30 min后，在517 nm处测定的吸光值为Ai；另取2 mL 2 mg/mL黑豆分离蛋白酶解产物，加入无水乙醇2 mL，避光反应30 min后，在517 nm处测定的吸光值为Aj；以2 mL 0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇作参考，避光反应30 min后，在517 nm处测定的吸光值为A0。按下式计算DPPH自由基清除率(K)。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)还原力(OD值)测定：取2 mL 2 mg/mL的样品溶液，加入2 mL磷酸盐缓冲液、2 mL铁氰化钾溶液，均匀混合，在50℃水浴下保温20 min，再加入2 mL三氯乙酸溶液，振荡摇匀后离心。取上清液2 mL，加入2 mL去离子水和0.4 mL三氯化铁溶液，振荡摇匀后在50℃水浴下保温10 min，在波长为700 nm下进行比色。以去离子水代替样品重复以上操作，作为空白。还原力以OD值表示。

2 结果与讨论

2.1 Alcalase酶解黑豆分离蛋白单因素试验

2.1.1 加酶量的确定

配制质量分数4%的黑豆分离蛋白分散液，在酶解温度50℃、酶解时间100 min、pH 9.5条件下，分别选择加酶量为1%、2%、4%、6%、8%进行酶解，测定酶解产物的抗氧化性(·OH清除率)及水解度，结果见图1。

注：不同字母代表差异显著，p<0.05。下同。图1 加酶量对酶解产物的水解度和抗氧化性的影响

由图1可知，加酶量达到4%之前，随着加酶量的增加，蛋白质肽键断裂的速度增加，导致酶解产物的水解度增加，抗氧化性也逐渐增强，当加酶量继续增大时，水解度并未显著增加，·OH清除率反而下降。因此，选择加酶量4%进行下一步试验。

2.1.2 酶解时间的确定

配制质量分数4%的黑豆分离蛋白分散液，在加酶量4%、酶解温度50℃、pH 9.5条件下，分别选择酶解时间为60、80、100、120、140 min进行酶解，测定酶解产物的抗氧化性及水解度，结果见图2。

图2 酶解时间对酶解产物的水解度和抗氧化性的影响

由图2可知，在反应的最初阶段，随着酶解时间的延长，酶解产物的水解度和抗氧化性都增加。当酶解时间达到80 min时，水解度和抗氧化性都较高，分别为27.19%和22.25%。这是因为随着酶解时间的延长，蛋白质水解生成的肽增加，延长酶解时间，·OH清除率和水解度升高；此后，·OH清除率和水解度都趋于平缓，在统计学上无显著差异。因此，选择酶解时间80 min进行下一步试验。

2.1.3 酶解温度的确定

配制质量分数4%的黑豆分离蛋白分散液，在加酶量4%、pH 9.5、酶解时间80 min条件下，分别选择酶解温度为45、50、55℃进行酶解，测定酶解产物的抗氧化性及水解度，结果见图3。

图3 酶解温度对酶解产物的水解度和抗氧化性的影响

由图3可知，酶解温度为50℃时，酶解产物对·OH清除率达到20.47%，水解度达到25.81%，在酶解温度高于50℃后，·OH清除率和水解度均无显著性差异。Alcalase最适温度在40～55℃范围内，温度过高或过低都会影响酶活力。因此，选择酶解温度50℃进行下一步试验。

2.1.4 底物质量分数的确定

配制底物质量分数分别为4%、5%、6%、7%、8%的黑豆分离蛋白分散液，在加酶量4%、酶解温度50℃、pH 9.5、酶解时间80 min条件下进行酶解，测定酶解产物的抗氧化性及水解度，结果见图4。

图4 底物质量分数对酶解产物的水解度和抗氧化性的影响

由图4可知，在底物质量分数低于5%时，随着底物质量分数的增加，酶解产物的水解度和抗氧化性增加。根据酶促反应原理[15]，底物浓度较小时，随着底物浓度的增加，能够被酶利用的底物增加，此时水解产生的肽段增多，因此·OH清除率升高。而当底物浓度过高时，由于体系浓度过高，使酶与底物的接触面积减小，蛋白酶无法完全作用于底物，·OH清除率下降。因此，选择底物质量分数5%进行后续试验。

2.2 Alcalase酶解黑豆分离蛋白正交试验

在单因素试验的基础上，以抗氧化性(·OH清除率)为指标，以酶解时间、加酶量、底物质量分数和酶解温度为考察因素，设计四因素三水平的正交试验，正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验设计及结果

由表2可知，影响抗氧化性的因素主次顺序为加酶量>酶解温度>酶解时间>底物质量分数，各因素水平的最优组合为A1B1C2D2，即酶解时间70 min、加酶量3%、底物质量分数6%、酶解温度55℃，在此条件下进行验证试验，·OH清除率为21.62%。

2.3 超滤对黑豆分离蛋白酶解产物抗氧化性的影响

对上述优化条件下所得的酶解产物经过超滤分级后，测定不同截留相对分子质量的酶解产物的抗氧化性，结果如图5所示。

图5 不同相对分子质量组分的黑豆分离蛋白酶解产物的抗氧化性

由图5可知，超滤处理对黑豆分离蛋白酶解产物的抗氧化性影响较大。与未超滤酶解产物相比，相对分子质量3～5 kDa和小于3 kDa组分的抗氧化性都有明显增加。尤其是相对分子质量小于3 kDa 的组分，与未超滤酶解产物相比，其·OH清除率由21.62%增加至29.54%，DPPH·清除率由9.06%增加至22.05%，还原力(OD值)由0.362增加至1.298。随着相对分子质量的减小，体系内短肽链逐渐增多，能够发挥抗氧化作用的端基逐渐暴露出来，因此抗氧化性明显增强。

3 结 论

Alcalase酶解黑豆分离蛋白制备抗氧化肽的最优条件为：加酶量3%，底物质量分数6%，酶解温度55℃，酶解时间70 min。在最优条件下酶解产物对·OH清除率为21.62%；酶解产物的超滤分级组分表现出不同的抗氧化性，相对分子质量小于3 kDa的组分抗氧化性最高，·OH清除率为29.54%，对DPPH·清除率为22.05%，还原力(OD值)为1.298。