老年大鼠大脑中动脉永久性缺血与缺血再灌注 对大脑损伤的比较研究

许娜，渠静，王赛楠，江炜，奥婷，张君，张芹，肖淑英，张瑞华

（首都医科大学附属北京潞河医院 1.老年医学科，2.中美神经研究所，北京 101149）

缺血性脑卒中是中老年人易患的三大疾病之一，呈高发病率、高致残率和高死亡率的趋势，给社会和家庭带来沉重负担。脑缺血发病后出现缺血再灌注（ischemia reperfusion, IR）的相关问题，既可以改善脑组织的血液供应，恢复神经功能，又可导致损伤[1]。目前脑I/R带来保护或损伤的机制尚不清晰，炎症和氧化反应可能是重要的因素[2-4]。本研究采用大鼠中脑动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）的方法复制动物模型，观察老年大鼠大脑I/R后脑梗死相关指标的改变[5]。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性老年SD大鼠（北京维通利华公司提供）30只，体重520～550 g，术前1周适应环境。将大鼠随机分为假手术组（Sham组）、永久性缺血组 （I组）和缺血再灌注组（I/R组），每组10只。I/R组插入线栓2 h后拔出，I组仅插入线栓不拔出，Sham组在麻醉后仅分离动脉。

1.2 实验试剂及仪器

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）（北京兰博利德生物技术有限公司），硅胶线栓（北京西浓科技有限公司），高迁移率族蛋白-1（high mobility group protein 1, HMGB1）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）ELISA试剂盒、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），HMGB1单克隆抗体（美国Abcam公司），β-actin多克隆抗体（北京冠星宇科技有限公司）。

1.3 动物模型的复制

将老年大鼠置入麻醉机诱导箱内全身麻醉2～3 min，置于手术台改用呼吸导管维持麻醉，大鼠全身肌肉松弛，仰卧固定，剃去颈前区毛发，消毒手术区域皮肤，行颈正中切口，钝性分离皮下组织，用自制拉钩分离大鼠右侧乳突肌与胸骨舌肌之间的肌间隙，暴露颈总动脉，钝性分离颈总动脉与周围组织，显微镊挑出颈总动脉穿线备用。钝性分离颈内外动脉后，电凝颈外动脉小分支，于距颈总动脉3～4 mm处结扎颈外动脉并电凝离断，在游离血管残端与颈总动脉间打一活结。动脉夹夹闭颈总动脉及颈内动脉，在颈外动脉残端剪一小口，将硅胶线栓沿颈内动脉的夹角外切口插入，将颈外动脉残端拉向外上方，使之与颈内动脉走向平行，将线栓沿颈内动脉走向轻柔缓慢推进，当感觉到有阻力时，提示线栓进入大脑中 动脉[5-6]。

1.4 脑血流检测

老年SD大鼠经异氟烷诱导并维持麻醉，俯卧位固定，沿头皮正中切开，用双氧水去除骨膜及颅骨表面的脂类，充分暴露颅骨和前囟。在前囟后2 mm、右侧旁开5 mm处，用小型颅骨钻将颅骨磨薄（不能钻透）。用激光多普勒仪（瑞典PeriFlux5000系统）监测血流。

1.5 脑梗死体积测量

术后24 h麻醉大鼠，快速断头取脑组织，将脑组织切片置于2% TTC溶液中染色[7]。可见梗死灶区呈白色，正常组织呈红色，部分组织由白色向红色过渡。用Image J 1.42加以分析（NIH图像分析软件）。

1.6 脑组织HMGB1、MDA含量及SOD活性检测

各组大鼠处死后去脑组织，提取蛋白，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，使用酶联仪于450 nm波长处测吸光度值，通过绘制标准曲线求出标本中的HMGB1、MDA及SOD质量浓度。

1.7 Western blotting检测脑组织HMGB1蛋白的表达

大鼠处死后取脑组织，置于冰上研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度。取10μg蛋白进行凝胶电泳。当电泳完成后，电转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入单克隆抗体HMGB1（1∶10 000稀释）室温孵育2 h。TBST洗涤后，加入二抗室温孵育1 h。TBST洗涤，电化学发光试剂显色。β-actin作为内参，使用LabWork 4.0图像分析软件进行检测。每份样品检测3次，取其平均值。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠脑血流比较

3组大鼠术后0、2、6、12及24 h的脑血流量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果如下：①不同时间点的脑血流量比较，差异有统计学意义（F=18.267，P=0.000）；②3组的脑血流量比较，差异有统计学意义（F=103.912，P=0.000）；③各组脑血流量变化趋势比较，差异有统计学意义（F=19.183，P=0.000）。见表1和图1。

表1 3组大鼠不同时间点脑血流量比较（n =10，ml/min，±s）

表1 3组大鼠不同时间点脑血流量比较（n =10，ml/min，±s）

组别0 h2 h6 h12 h24 h Sham组233.6±2.991235.5±2.500230.7±2.371234.5±1.918235.7±1.658 I组234.1±3.515111.5±2.25576.39±3.65748.75±1.25065.34±2.178 I/R组235.0±2.699110.8±2.175123.8±3.018 142.3±2.097154.3±1.918

图1 3组大鼠脑血流量变化趋势（n =10，±s）

图2 3组大鼠脑梗死体积比较（n =10，±s）

2.2 3组大鼠脑梗死体积比较

Sham组、I组及I/R组大鼠脑梗死体积百分比分别为（6.673±1.690）%、（33.523±6.112）%和（20.167±4.733）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=38.83，P=0.000）。与Sham组相比，I组升高（P＜0.05）；与I组相比，I/R组降低（P＜0.05）。见图2。

2.3 3组大鼠脑组织SOD活性及MDA、HMGB1含量比较

Sham组、I组及I/R组大鼠脑组织SOD活性分别为（468.974±34.429）、（310.247±49.118）和（388.971±63.496）pg/ml，经方差分析，差异有统计学意义（F=15.410，P=0.000）；与Sham组相比，I组降低（P＜0.05），与I组相比，I/R组升高（P＜0.05）。Sham组、I组及I/R组大鼠脑组织MDA含量分别为（103.009±44.517）、（228.558±41.504）和（163.879± 35.709）pg/ml，经方差分析，差异有统计学意义（F= 14.780，P=0.000）；与Sham组相比，I组升高（P＜0.05），与I组相比，I/R组降低（P＜0.05）。Sham组、I组及I/R组大鼠脑组织HMGB1含量分别为（137.388±31.958）、（336.370±57.112）和（211.353±38.913）pg/ml，经方差分析，差异有统计学意义（F=33.780，P=0.000）；与Sham组相比，I组升高（P＜0.05），与I组相比，I/R组降低（P＜0.05）。见图3、4。

图3 3组大鼠脑组织SOD活性及MDA含量比较（n =10，±s）

图4 3组大鼠脑组织HMGB1含量比较（n =10，±s）

3 讨论

大脑中动脉是缺血性疾病的好发部位，缺血机制和治疗手段的探索一直是神经科学领域关注的重要问题。在脑缺血机制的研究中，血管线栓阻塞大脑中动脉模型应用广泛[8]。本实验采用该方法分别复制老年大鼠永久性局灶性缺血模型和缺血2 h后拔出线栓形成的老年大鼠局灶性脑IR模型。

脑IR相关保护和损伤的机制尚不明确，其中炎症反应可能是重要因素[9-12]。炎症反应中期，机体释放大量的促炎因子，引发炎症反应，造成组织水肿甚至损伤；而炎症反应晚期，肿瘤坏死因子-α等细胞因子可促进HMGB1的释放，导致炎症反应，加重组织损伤[13-14]。CHEN等[15]的研究也相同结果，脑缺血损伤患者血浆中HMGB1表达高于正常人群。但是也有专家认为，IR相关保护方面的机制研究不足[2]。因此，笔者设计本实验，观察脑IR后梗死体积、SOD、MDA及HMGB1等相关指标。SOD是细胞内主要的抗氧化酶，能清除氧自由基从而抵抗其对细胞造成的损伤。MDA是细胞膜脂质氧化后的产物之一，也是细胞遭受氧化应激损伤的标志物[16]。本研究观察IR过程中老年大鼠脑组织中SOD活性及MDA含量，结果表明再灌注后SOD活性升高，MDA含量降低，提示再灌注可能通过提高抗氧化酶活性，降低氧化应激产物，从而减轻脑缺血后大脑的损伤。

本研究的另一结果是I组大鼠脑组织中HMGB1的表达高于Sham组，I/R组大鼠脑组织HMGB1的表达低于I组，提示HMGB1参与永久性缺血和IR的炎症反应过程，并且再灌注可能通过降低HMGBI的释放从而减轻脑缺血后对大脑的损伤。

综上所述，与永久性缺血相比，IR对脑梗死具有一定的保护作用，该作用可能通过提高抗氧化酶活性，降低氧化应激产物，抑制HMGB1的表达等途径得以实现，但其具体的分子调控机制，尚需进一步深入 研究。