Aβ1-42寡聚体对α-syn过表达SHSY5YA53T细胞自噬功能的影响☆

郭曼莉 高玉元 张晴曦 聂坤 王丽娟

帕金森病（Parkinson disease，PD）是最常见的神经退行性疾病之一，其主要的病理改变是黑质-纹状体多巴胺能神经元的脱失。α-突触核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）异常聚集形成的的路易小体，与神经元的死亡密切相关[1]。α-突触核蛋白基因（SNCA）A53T点突变是家族性PD常见致病突变类型[2-3]。β淀粉样蛋白（Aβ）级学说是阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）的主流学说，Aβ1-42是AD主要病理成分，有多种聚合形态，其中Aβ1-42寡聚体毒性最强。研究表明，Aβ1-42参与PD的病理发病过程，与PD患者认知损害和步态障碍相关[4-5]。Aβ1-42寡聚体可促进α-syn的聚集和神经元的死亡。自噬是神经元内重要的蛋白途径，αsyn的自噬性降解障碍被认为是PD的重要病理过程。Aβ1-42对PD自噬功能的影响鲜有文献报道。本研究将建立α-synA53T过表达的帕金森病体外模型，检测Aβ1-42寡聚体处理前后细胞自噬相关蛋白 p62、LC3、Beclin-1的变化，以探究 Aβ1-42寡聚体在PD中对细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养SHSY5Y细胞由广州赛库生物技术有限公司进行STR鉴定，以含体积分数0.10的胎牛血清、100 U/mL的青链霉素双抗的DMEM/F-12培养基培养，置于37°C、含体积分数0.05的CO2培养箱中传代培养，每2～3 d传代1次。

1.2 细胞慢病毒转染在转染前1 d，将处于对数生长期的SHSY5Y细胞按每孔105个细胞接种于24孔板中，使其在转染次日达到80%的融合度。24 h后吸去旧培养液，加入新的无血清培养液，在培养液中分别加入纯化的携带SNCAA53T慢病毒液和携带空载体病毒液 （广州复能基因有限公司），12 h更换为含 10%FBS的 DMEM/F12培养基继续培养;慢病毒感染72 h后，细胞培养时加入终浓度为 1 μg/mL嘌呤霉素筛选 SNCAA53T稳定过表达的 SHSY5Y细胞（SHSY5YA53T组），以及空载体对照细胞（SHSY5YCON组），细胞继续扩增培养。

1.3 荧光实时定量PCR(RT-qPCR)法检测SNCA在SHSY5Y细胞中的表达细胞转染慢病毒后嘌呤霉素筛选 7 d，将 SHSY5YA53T组，SHSY5YCON组，SHSY5Y正常细胞组细胞用Trizol法提取总RNA，进行逆转录和荧光实时定量PCR扩增，以检测SNCAmRNA的表达情况。引物使用Primer-BLAST在线设计，华大基因科技有限公司合成。SNCA引物的上游序列为：5'-AA GAGGGTGTTCTCTATGTAGGC-3'，下游序列为：5'-GCTCCTCCAACATTTGTCACTT-3'；内参照ACTB引物的上游序列为：5'-GGCACCCAGCACAATGAAG-3'，下游序列为：5'-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3'。 qPCR 反应参数为：95°C 预变性 30 s，95°C 5 s、60°C 30 s，循环 40 次。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖将处于对数生长期的细胞按每孔105接种于96孔板中，加入不同浓度的 Aβ1-42寡聚体，置于 37°C、体积分数 0.05 CO2。培养箱中培养24 h后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，细胞培养箱内继续避光孵育4 h;在酶标仪450 nm测定吸光度。

1.5 Aβ1-42寡聚体的制备[6-7]冰上用HFIF将Aβ1-42多肽（英国ABCAM）充分溶解至1mmol/L，室温下于通风处内挥发过夜，制备得Aβ1-42肽膜。使用时用预冷的无水DMSO溶解肽膜至5 mmol/L，加入PBS获得100 μmol/L的Aβ1-42单体母液。取适量的Aβ1-42单体母液于4℃放置24 h，制备得Aβ1-42寡聚体。

1.6 细胞接种与处理细胞吹打制成单细胞悬液，用DMEM/F-12培养液将细胞密度稀释为1×106/L，每孔2000 μL接种至多聚-L-赖氨酸预处理的6孔板中，于37°C、含体积分数0.05的 CO2培养箱中培养。分组处理：A53T组：无血清培养基孵育SHSY5YA53T24 h；CON组：无血清培养基孵育SHSY5YNC24 h；A53T+Aβ 单组：10 μmol/L 的Aβ1-42单体孵育SHSY5YA53T24h；CON+Aβ单组： 用10 μmol/L的Aβ1-42单体孵育SHSY5YNC24 h。A53T+Aβ寡组：10 μmol/L 的 Aβ1-42寡聚体孵育SHSY5YA53T24 h；CON+Aβ 寡组：用 10 μmol/L 的Aβ1-42寡聚体孵育SHSY5YNC24 h。

1.7 Western blot法测定 p62、LC3、Beclin-1 表达变化 各组细胞处理后，使用RIPA（碧云天）裂解提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量后，按20 μg加样量进行免疫沉淀。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法电转移到PVDF膜上，将PVDF膜用脱脂奶粉常温封闭2 h，分别置于p62（1：1000，CST，兔多克隆抗体）、LC3 一抗(1∶1000，CST)、Beclin-1(1：1000，CST)、GAPDH 一抗(1：10000，CST)孵育，4°C摇床过夜，然后与 HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶10000)室温孵育1 h后，用 ECL化学发光试剂盒曝光显色，条带的强弱用ImageJ分析软件进行灰度分析。以 Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ与GAPDH的平均灰度的比值表示 Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ蛋白的表达水平。

1.8 统计学方法采用GraphPad Prism6软件进行统计分析，实验结果以±s表示，两组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 外源SNCA在SHSY5Y细胞中的表达细胞转染慢病毒后嘌呤霉素筛选7 d，SHSY5YA53T组mRNA和α-syn表达水平较SHSY5Y组明显增高（P＜0.05），基因过表达 41 倍。 SHSY5YCON组和SHSY5Y正常细胞比较无统计学意义 （P＞0.05）。SNCAmRNA RT-qPCR结果和α-syn Western blot结果见图1。

图1 外源α-syn基因在SHSY5Y细胞中的表达 A为SNCA mRNA在各组细胞中的表达；B为α-syn在各组细胞中的表达量。 *P＜0.05

2.2 SHSY5Y组、SHSY5YCON 组、SHSY5YA53T组细胞增殖不受抑制SHSY5Y组、SHSY5YCON组、SHSY5YA53T组细胞分别接种至 96孔板，1×104细胞/孔，相同条件下培养，CCK-8法连续5日检测细胞活力，结果显示，各组细胞生长状况良好。各组细胞增殖速度无统计学差异（P＞0.05）。

2.3 Aβ1-42寡聚体抑制细胞的增殖不同浓度的Aβ1-42寡聚体处理 SHSY5YCON组、SHSY5YA53T组细胞24 h，细胞的增殖均受抑制，随着Aβ1-42寡聚体浓度的增加，细胞增殖的抑制效果更明显。SHSY5YA53T组的抑制效果较SHSY5YCON组显著。

图2 不同浓度Aβ1-42寡聚体干预细胞24 h后细胞的活力检测*：与 SHSY5YCON对照组相比，P＜0.05;#：与 0 μmmol/LAβ1-42寡聚体处理组相比，P＜0.05

2.4 细胞自噬相关蛋白的表达Western blot结果显示，与SHSY5YCON对照组相比，Aβ1-42单体和寡聚体处理后，SHSY5YA53T组细胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）见图3。两组间P62蛋白表达均有增加趋势，差异无统计学意义（P=0.489）。

3 讨论

本研究通过构建α-synA53T过表达的SHSY5Y细胞模型模拟PD神经元的病理特点，结果提示，α-synA53T过表达的SHSY5Y细胞，增殖存活率无明显下降，α-synA53T过表达对细胞无明显的毒性作用，PAL、SCARLATA等[8-9]研究认为只有在特定的氧化应激或炎症等诱发因素干扰下，过表达αsyn才有细胞毒性作用。

图3 Western Blot法检测自噬相关蛋白的表达 A：自噬相关蛋白的表达情况；B：LC3-Ⅱ的相对表达水平；C：p62蛋白的相对表达水平；D：Beclin-1蛋白的相对表达水平 *P＜0.05，**P＜0.001

相关临床研究发现与健康对照相比，Aβ1-42在PD患者脑组织中沉积增多[4]，且与PD患者认知损害和步态障碍相关[4-5]。GILBERT等[10]发现降低Aβ的表达可以延缓α-syn相关的神经退行性改变。本研究结果发现，Aβ1-42寡聚体处理后，αsynA53T过表达SHSY5Y细胞和对照组SHSY5Y细胞增殖受抑制，在两组细胞中均具有明显的细胞毒性，对α-synA53T过表达组细胞的毒性作用更显著，与LIN等[11]研究结果相符。自噬是神经元清除异常折叠蛋白的重要途径，在AD中，Aβ1-42可损害自噬功能引起tau蛋白的沉积[12-13]。本研究对比Aβ1-42寡聚体处理前后，SHSY5YA53T组和SHSY5YCON对照组自噬相关蛋白 LC3-Ⅱ，p62，Beclin-1的表达水平，SHSY5YA53T组LC3-Ⅱ蛋白和Beclin-1蛋白的表达相比对照组减少，p62蛋白表达未见统计学差异。 LC3-Ⅱ是目前最广泛检测的自噬指标，随细胞内自噬功能激活增多，Beclin-1下调提示细胞自噬功能活性受抑制[14]。α-synA53T过表达的细胞中，Aβ1-42寡聚体可抑制细胞的自噬功能，在对照组细胞中，未观察到自噬相关蛋白的改变。p62作为另一重要的自噬指标，可连接LC3-Ⅱ，介导泛素化底物的自噬性降解，本研究两组细胞中，p62蛋白改变均不明显，可能与p62蛋白变化的滞后性相关[15]。本研究设立Aβ1-42单体处理对照组，自噬蛋白变化趋势与Aβ1-42寡聚体处理组相符，可能为细胞37℃孵育过程与寡聚化处理过程相似，Aβ1-42单体产生聚集[7]。

综上所述，通过慢病毒转染构建人α-synA53T过表达的SHSY5Y细胞模型，可以稳定模拟PD神经元α-syn过表达的病理表现，可作为PD发病机制研究的体外模型。Aβ1-42寡聚体抑制该细胞模型的存活和增殖，与对照组细胞相比，Aβ1-42寡聚体处理后，过表达组LC3-Ⅱ、Beclin-1自噬相关蛋白表达减少，提示Aβ1-42寡聚体通过抑制细胞的自噬功能在PD发病过程中促进神经元的死亡。本研究的不足之处是，Aβ1-42寡聚体在PD体外模型中抑制自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达，Aβ1-42寡聚体也可能是PD自噬功能受损的产物，后续研究仍需进一步探索Aβ1-42寡聚体在PD自噬损伤过程的具体机制。