人脐静脉内皮细胞来源外泌体有助于促进缺血性脑卒中小鼠的康复

张晓星， 胡 慧， 李跃华

上海交通大学附属第六人民医院放射科，上海 200233

脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率三大特点，是全球第二大死因。干细胞治疗缺血性脑卒中已成为近年来的研究热点，多种干细胞治疗缺血性脑卒中具有可行性及有效性。虽然干细胞治疗前景可观，但细胞治疗存在归巢至大脑有限、引起血管栓塞等问题。外泌体是一种纳米级的小囊泡，直径30～100 nm，包含许多生物活性分子，如蛋白质、RNAs、DNAs、脂质及微小RNA，适用于功能小分子的传递，在细胞间的交流中起着非常关键的作用[1-3]。与细胞治疗相比，外泌体治疗因为其低免疫原性、无血管阻塞风险、能够通过血脑屏障等而具有独特的优势[4-7]。研究发现，新生小鼠脑部受到缺血缺氧性损伤后，HUVECs对受损的神经元及血管内皮细胞具有保护作用[8]。干细胞向损伤的组织分泌细胞因子、生长因子、微泡等来调节受损细胞的功能，促进机体自我修复。HUVECs来源的外泌体即HUVECs-exo能促进神经干细胞增殖，减少细胞凋亡，保护成熟的神经元[9]。因此，HUVECs分泌的外泌体对促进缺血性脑卒中的恢复具有潜在价值。本研究将提取人脐静脉内皮细胞外泌体，制备小鼠短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)模型，探讨HUVECs-exo能否减小缺血性卒中后的梗死范围，促进梗死周围区域突触的重塑、神经及血管的新生，改善缺血性脑卒中后的神经功能恢复。

1 材料与方法

1.1 实验动物及外泌体的获取及鉴定 ICR雄性小鼠22只，体质量25～30 g，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验所用动物均经上海市第六人民医院伦理委员会批准。

人脐静脉内皮细胞的培养及外泌体的提取：第3代人脐静脉内皮细胞购自ATCC美国细胞库。经复苏、传代、培养，当HUVECs细胞融合度达到80%～90%时，换无血清培养基继续培养24 h，收集HUVECs细胞上清液，并在4℃、400×g条件下进行离心，时间为20 min，去除死亡的细胞及细胞碎片。用0.22 μm滤器过滤所获得的上清液，移至超滤管中，浓缩上清液，在4℃、4 000×g的条件下再次离心，时间为30 min，将上清液浓缩至200～300 μL，再用超速离心机进行离心，4℃、10 000×g，30 min。结束后，转移至新的离心管，再次进行超速离心，4℃、100 000×g，70 min。结束后，去除上清液后加入PBS(15 mL)使获得的沉淀成分溶解。用过滤器除菌后，再次离心，4℃，4 000×g，30 min，使其浓缩至200～300 μL，存放在-80℃冰箱中冻存备用。

外泌体的鉴定：NTA技术检测外泌体粒径，透射电镜观察外泌体的形态，Western印迹检测外泌体特征性标志物CD9、CD63、CD81的表达。

1.2 小鼠大脑中动脉短暂性闭塞模型的建立 4%水合氯醛麻醉小鼠，75%乙醇消毒小鼠头部皮肤，切开暴露小鼠的颅骨，用激光多普勒血流仪测量左侧大脑中动脉供血区域的术前基础血流，测量结束后将小鼠仰卧位固定在恒温加热垫上[肛温(37±0.5)℃]；将小鼠放在显微镜视野下，用75%乙醇消毒小鼠颈部皮肤，做颈部正中切口，并且钝性分离颈部皮下组织，暴露左侧颈总动脉，结扎左侧颈总及颈外动脉，在颈外动脉结扎处下方剪一小口，将6-0线拴插入反折至颈内动脉，当感到有轻微阻力感时，停止插入，再次用激光多普勒血流仪测量左侧大脑中动脉供血区域的术后血流，术后血流降低至术前20%以下视为tMCAO造模成功。90 min后，将线栓拔出，结扎左侧颈外动脉残端，缝合皮肤，再次用激光多普勒血流仪复测皮质血流，观察再灌注是否成功，缝合头部皮肤，消毒，将小鼠放入笼中，待其苏醒。

1.3 小鼠尾静脉注射及BrdU腹腔给药 小鼠tMCAO造模成功后24 h内外泌体尾静脉给药，实验组外泌体30 μg，体积100 μL/只，对照组PBS 100 μL/只。BrdU在小鼠造模成功后连续14 d腹腔注射给药，剂量为50 mg/kg。

1.4 小鼠行为学测试 在tMCAO造模成功后1、3、7、14、21、28 d进行神经损害严重程度评分(mNSS)。

1.5 小鼠磁共振扫描及脑梗死范围的计算 小鼠tMCAO造模后第3天及28天，让小鼠行磁共振T2序列扫描(Bruker，11.7T)，T2序列扫描参数如下，TR=2 850 ms，TE=30 ms，扫描视野=256×256，FOV=16×16，层厚=0.5 mm，层间距=0。Image J软件计算梗死范围。梗死范围[10]=(对侧区域-同侧非梗死区域)/对侧区域×100%。

1.6 Western印迹法检测小鼠梗死周围区域突触素及PSD-95的表达 将小鼠断头取脑，获得小鼠脑标本，将小鼠脑标本放入小鼠模具中，取梗死周围区域的脑组织，放入蛋白裂解液中，在冰上用超声破碎机破碎组织，匀浆后裂解30 min，后进行离心，4℃，12 000×g，30 min，获取上清移至EP管中，放入-80℃冰箱中保存。BCA法测试蛋白浓度，10% SDS-PAGE分离蛋白样品，PVDF转膜，10% BSA封闭后，加入相应一抗及二抗，在ECL试剂盒进行显影。

1.7 免疫荧光双染检测小鼠梗死周围区域CD31、DCX、NeuN表达 从-80℃冰箱中取出小鼠片子，室温吹干，4%多聚甲醛固定。PBS洗涤。0.3% Triton-X100溶液破膜10 min。PBS洗涤。10% BSA封闭1 h。加一抗(CD31 1∶200，NeuN 1∶300，DCX 1∶250)，4℃孵育过夜。PBS洗涤后，避光加入荧光二抗室温孵育1 h，PBS洗涤后行DAPI染色(1∶1 000稀释)，再次PBS洗涤，加入荧光防淬灭封片剂，封片后吹干。显微镜下拍照。

2 结 果

2.1 HUVECs细胞的培养 第3代HUVECs细胞购自ATCC美国细胞库(No.CRL-1730)，按照说明书将HUVECs细胞复苏、培养、传代，传代第2天可见HUVECs细胞密度较低，当融合度达到90%时，可见HUVECs细胞呈现鹅卵石样改变，细胞生长状态好，可进行后续实验(图1)。

图1 HUVECs在不同密度下的细胞形态

2.2 外泌体的提取与鉴定 Nanosight检测粒径结果显示，HUVECs-exo直径主要为30～100 nm，极少数大于200 nm(图2A)。Western印迹检测到外泌体特征性标志物CD9、CD63、CD81(图2B)。透射电镜观察HUVECs-exo形态呈圆形(图2C)。

图2 外泌体提取与鉴定

A：Nanosight检测HUVECs-exo直径；B：Western印迹法检测HUVECs-exo特征性标志物CD63、CD9和CD81；C：透射电镜观察HUVECs-exo形态，呈圆形

2.3 HUVECs来源外泌体改善缺血性脑卒中小鼠神经功能恢复 结果显示，在小鼠tMCAO后，PBS对照组及HUVECs-exo组神经功能评分较假手术组明显变差，在1、3、7 d后，HUVECs-exo组小鼠神经功能较PBS对照组相比无明显差异，但在14、21、28 d，HUVECs-exo组小鼠神经功能较PBS对照组明显改善(表1、图3)。

表1 各组小鼠mNSS评分 n=6,

*P<0.05与假手术组相比；△P<0.05与PBS对照组相比

图3 各时间点假手术组、PBS对照组、HUVECs-exo组小鼠mNSS评分的比较

2.4 HUVECs来源外泌体能减少缺血性卒中后梗死范围 在小鼠tMCAO后第3天及第28天，小鼠行磁共振T2扫描，用Image J软件计算梗死范围。结果显示，在第3天，HUVECs-exo组及PBS对照组小鼠梗死范围未见明显差异，但在第28天发现HUVECs-exo组梗死范围显著小于PBS对照组(P<0.05，图4)。

2.5 HUVECs来源外泌体促进神经元前体增殖并促进神经元的成熟 免疫荧光结果(图5、图6)显示:与PBS对照组相比，HUVECs-exo组小鼠梗死边缘区新生神经前体细胞及成熟神经元显著增多，差异具有统计学意义(DCX：9.75±1.71vs1.0±0.82,P<0.01; NeuN:30.25±4.34vs3.25±0.50,P<0.01)。

图4 两组小鼠梗死范围的比较

图5 小鼠tMCAO后第28天DCX/BrdU免疫荧光双染结果

图6 小鼠tMCAO后第28天 NeuN/BrdU免疫荧光双染结果

2.6 HUVECs来源外泌体促进小鼠脑缺血性卒中后梗死边缘区的血管生成 免疫荧光双染结果显示，PBS对照组梗死周围区的CD31+/BrdU+双染阳性细胞数目为(3.00±0.82)个/每视野，HUVECs-exo治疗组双染阳性细胞数目为(7.00±1.83)个/每视野，HUVECs-exo组梗死边缘区新生血管较PBS对照组显著增多，差异具有统计学意义(P=0.015，图7)。

图7 小鼠tMCAO后第28天CD31/BrdU免疫荧光双染结果

2.7 HUVECs来源外泌体促进小鼠缺血性卒中后梗死边缘区突触的再生 Western印迹结果显示，与PBS对照组相比，HUVECs-exo组小鼠梗死边缘区Synaptophysin及PSD-95的表达显著增高(P<0.05，图8)。

图8 Western印迹法检测各组小鼠梗死边缘区Synaptophysin和PSD-95表达情况(A)及定量统计图(B) *P<0.05

3 讨 论

本研究提取且成功鉴定人脐静脉内皮细胞外泌体，通过磁共振成像证明HUVECs来源的外泌体能够减小缺血性脑卒中后的梗死范围，免疫荧光结果显示HUVECs组小鼠梗死边缘区新生神经元数目及新生血管的数目显著高于PBS组，说明HUVECs-exo能够促进小鼠缺血性卒中后梗死边缘区神经元新生及成熟并且促进血管的新生。Western印迹结果显示，HUVECs-exo组小鼠梗死边缘区Synaptophysin及PSD-95的表达较PBS对照组相比显著增高，说明HUVECs-exo能够促进突触的重塑，与14 d后小鼠的mNSS评分相符，说明HUVECs-exo能够促进缺血性脑卒中后的神经功能恢复。

脑梗死范围是判断脑功能恢复的直观指标。本研究发现HUVECs-exo能够减小梗死范围。Chen等[11]通过给大鼠静脉注射异种脂肪间充质干细胞来源的外泌体，结果显示大鼠脑梗死的体积显著减小。本实验在造模成功后第3 天及第28 天后对小鼠行磁共振检查，发现脑梗后第3天两组小鼠的梗死范围没有显著差异，但发现第28 天 HUVECs-exo组小鼠的梗死范围较PBS对照组相比显著减小(P<0.05)。结果说明HUVECs-exo与干细胞来源的外泌体作用相类似，能够减小卒中后的梗死范围，对脑卒中的治疗具有一定的潜在价值。

梗死后血管新生是脑卒中预后的重要指标。荧光染色细胞计数发现，HUVECs-exo组小鼠梗死边缘区新生血管的量显著高于PBS对照组(P<0.05)。卒中预后与血管新生密不可分。在脑卒中慢性期可以通过新生的血管来预测卒中后脑的可塑性与功能的恢复[12]。缺血半暗带中血管新生的数量与患者生存期的延长存在一定的相关性，这说明促进血管新生可能对脑卒中的预后有益。本研究发现，HUVECs-exo组血管新生较PBS对照组相比显著增加，且小鼠mNSS评分逐渐改善。Yang等[13]将补阳还五汤与MSCs-exo联合治疗可以提高外泌体miR-126的表达，最终促进血管新生。本研究结果证明，与上述不同细胞来源的外泌体相类似，HUVECs-exo能够促进缺血性脑卒中后梗死边缘区血管生成，有利于脑卒中的恢复。

梗死边缘区神经前体细胞及成熟神经元的多少对卒中后的恢复具有非常重要的作用。研究表明促进内源性神经发生有可能成为治疗神经系统疾病一种理想的选择[14-15]。本研究在小鼠缺血术后24 h，尾静脉注射HUVECs-exo，术后28 d免疫荧光结果显示DCX+/BrdU+及NeuN+/BrdU+双阳性细胞较PBS对照组明显增多，表明HUVECs-exo有利于缺血性脑卒中后的神经功能的恢复。Xin等[16]在大鼠缺血性卒中后24 h用MSCs来源的外泌体治疗，发现其能够改善大鼠卒中后的功能恢复，促进神经元的新生及神经突起的重塑，富含miR-17-92簇的MSCs-exo能够通过激活PI3K/Akt/MTOR/GSK-3信号通路来促进缺血性卒中后神经功能的恢复和增强神经的可塑性。本研究与文献报道相一致，说明HUVECs-exo能够促进神经的发生和成熟，促进其迁移至缺血部位，具有一定治疗缺血性脑卒中的潜力。

突触重塑对缺血性脑卒中后的恢复至关重要。脑内突触的再生和重塑与缺血性脑卒中后的认知记忆功能、运动功能及神经功能密不可分[17-18]。突触素和PSD-95是维持突触稳定性和可塑性的两个重要蛋白。PSD-95是促进突触成熟关键因子，它不但能调节突触活动，还能促进突触的稳定、完整，增加突触的可塑性，调节突触发挥生物学作用[19-20]。本研究中HUVECs-exo治疗组在术后28 d Western印迹结果显示PSD-95表达显著高于PBS对照组，且与同期小鼠的mNSS评分相符。突触素是附着在突触前膜的一种糖蛋白，发挥重要的生物学作用，参与囊泡和质膜的融合、吞噬和再循环[21]。此外，突触素对于神经递质的释放必不可少。有研究证明，突触素减少能减低大脑突触的可塑性[22]。本研究中术后28 d HUVECs-exo治疗组在Western印迹结果显示突触素Synaptophysin表达也显著高于PBS对照组，并且与同期的小鼠行为学mNSS评分相一致。因此，HUVECs-exo可以促进缺血性脑卒中后突触的重塑。

本研究虽然证明HUVECs-exo能够减小卒中后的梗死范围，促进梗死边缘区血管及神经元新生，对缺血性脑卒中后突触重塑有益，能够改善卒中后的神经功能预后，但仍存在诸多不足之处。第一，本研究仅选择短暂性大脑中动脉缺血模型进行研究，下一步将与永久性脑梗死的治疗效果进行比较。第二，本实验仅选择小鼠短暂性脑卒中后24 h进行给药，但是进行预处理及24 h后给药治疗效果与24 h给药效果的差异需要进一步探究，以选择最佳治疗时间及方式。第三，本实验给药剂量选择30 μg，还需要进一步比较不同给药剂量的差异，以选择最佳给药量。最后，本研究分子机制尚未阐明，在今后的研究中将对HUVECs来源外泌体的成分进行分析，并对梗死部位周围新生血管形成、神经及突触相关的基因改变进行进一步的研究，为HUVECs-exo的临床应用提供理论基础。