解淀粉芽孢杆菌草酸脱羧酶基因的克隆、原核表达与活力测定

白雪 张慧莉 黄冲

摘要：为进一步明确解淀粉芽孢杆菌C（10）的草酸脱羧酶基因的生物功能，克隆其关键基因对该基因进行原核表达。通过PCR技术克隆了淀粉芽孢杆菌C（10）的草酸脱羧酶基因，构建了原核生物表达载体pET28a-Baoxdc，对其进行表达与纯化。结果表明，扩增所获解淀粉芽孢杆菌C（10）的草酸脱羧酶全基因序列全长为1 161 bp，在大肠杆菌中进行表达，添加诱导剂IPTG、MnCl2至终浓度分别为0.6、6 mmol/L，诱导4 h时的酶活力和比活力最高，分别为3.793 2 U/mL和3.145 3 U/mg。

关键词：解淀粉芽孢杆菌;草酸脱羧酶;克隆;原核表达;酶活测定

中图分类号： Q786;S188  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0066-04

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为革兰氏阳性短杆菌，是一种好氧、嗜温并且产芽孢的杆状细菌[1]。它生长繁殖较快，可以利用的营养物质种类十分丰富，能够抗菌、消毒，可产生多种抗菌素和酶类，具有一定程度的广谱抗菌活性以及极强的抗逆性能，对人、畜无毒害作用[2]。

解淀粉芽孢杆菌的自身代谢产物中有一种重要的产物是γ-聚谷氨酸（poly-γ-glumatic，γ-PGA），它是自然界中的一些微生物（主要是芽孢杆菌属）合成的具有水溶性、可生物降解的阴离子型多聚氨基酸[3]。γ-聚谷氨酸拥有良好的吸水性、成膜性、絮凝性、成纤维性、阻氧性、可塑性以及黏结性，在食品工业、化妆品行业、菌种保藏及污水处理等方面具有广泛的用途[4]。自1942年Bovarnick等发现了芽孢杆菌可以在培养基中累积γ-PGA至今[5]，对于使用微生物发酵法合成γ-PGA的研究就一直比较活跃。

经查阅相关文献，在解淀粉芽孢杆菌γ-PGA的代谢通路中有一种活性较高的草酸脱羧酶，它能将草酸转化为甲酸，从而降解为二氧化碳，而草酸是γ-PGA的刺激剂，能刺激细胞内γ-聚谷氨酸的高产。草酸（oxalic acid，OA）是自然界中酸性最强的有机二元羧酸，能溶于水和乙醇，通常由植物、微生物通过水解草酰乙酸或氧化乙醛酸、抗坏血酸产生[6]。草酸脱羧酶（oxalate decarboxylase，OXDC）是一种包含Mn2+的均一聚合酶，属Cupin蛋白超家族[7];它可在没有辅因子的条件下催化草酸转化为甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代谢降解的主要催化酶之一[8]。基于这一原理，本试验将对草酸脱羧酶基因进行原核表达，并初步探究诱导表达条件。

目前，标准菌株解淀粉芽孢杆菌DSM7全基因组已被解析出来，根据生物信息学分析，其中oxdC序列为草酸脱羧酶基因[9]，但并未进行试验进行验证，同时也没有文献报道研究过解淀粉芽孢杆菌的草酸脱羧酶基因[10]。因此本试验重点阐述了来源于解淀粉芽孢杆菌C（10）的草酸脱羧酶基因oxdC经过克隆并构建新的重组载体，成功地转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在原核表达系统中得到稳定遗传，根据单因素梯度试验确定了重组草酸脱羧酶最佳的诱导表达条件，这为草酸脱羧酶的相关后续试验奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 解淀粉芽孢杆菌C（10）（B. amyloliquefaciens）为笔者所在实验室保藏;大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和BL21分别由石河子大学生命科学学院黄先忠教授和崔百明教授惠赠;原核表达载体pET28a（+）由石河子大学生命科学学院李鸿彬教授惠赠。

1.1.2 试剂 酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限公司;胰化蛋白胨购自BBI;琼脂糖购自BIOWEST;Tris购自ICN;SDS购自Biotech;乙二胺四乙酸二钠购自Biosharp;限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司;2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;Kanamycine、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、硼酸均购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌C（10）oxdC基因的克隆 根据NCBI网站基因数据库中解淀粉芽孢杆菌DSM7的草酸脱羧酶oxdC的基因序列，设计1对特异引物：oxdC-F，5′-CGGGATCCATGTCAAAAGAAAACAACTGCAATATCCCGC-3′（下划线为BamH Ⅰ酶切位点）;oxdC-R，5′-CCGCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACTGGATG-3′）（下划线为Xho Ⅰ酶切位点，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR的扩增，反应体系为2×Taq PCR Mastermix[其中包含0.1 U/μL Taq聚合酶、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2以及其他稳定剂和增强剂]25 μL，模板1 μL（每个反应小于1 μg），正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，加ddH2O补足50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶（浓度为1%）电泳分离、鉴定，根据marker片段比对扩增产物，确定扩增产物片段大小无误之后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的片段进行割胶回收[11]。

1.2.2 重组质粒pET28a-BaoxdC的构建 回收后的PCR产物用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，同時用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对表达载体pET28a（+）进行双酶切，37 ℃酶切3 h后使用琼脂糖凝胶电泳分离并对酶切产物进行检测，正确条带经割胶回收检测纯化之后，对oxdC酶切产物与pET28a（+）酶切产物按摩尔比1 ∶ 4进行过夜连接，使用T4 DNA连接酶进行连接，16 ℃过夜，以此来构建pET28a-BaoxdC重组质粒。检测并纯化连接产物。

将酶切鉴定和序列测定后的重组质粒pET28a-BaoxdC使用常规化学转化法（CaCl2）法进行化学转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，转化后的pET28a-BaoxdC重组子细胞涂布LB固体培养基平板，于37 ℃恒温培养12～16 h。

于平板上随机挑取10个边缘整齐、大小适中的转化子单克隆菌落，在装有15 mL LB液体培养基的试管中于37 ℃、200 r/min 振荡过夜培养，随后取菌液作为模板，以oxdC-F/oxdC-R作为引物进行菌液PCR，菌液PCR反应体系为2×Taq PCR Mastermix[其中包含0.1 U/μL Taq、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2以及其他稳定剂和增强剂]25 μL，模板接触即可（每个反应小于1 μg），正反向引物（10 μmol/L）各 2 μL，加ddH2O补足至50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25个循环;72 ℃ 充分延伸5 min。菌液PCR结果由琼脂糖凝胶电泳分离并鉴定，最后选取2个阳性克隆子，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 oxdC基因的原核表达及粗酶液的提取 将阳性克隆子的测序结果与NCBI基因组数据库中的解淀粉芽孢杆菌DSM7草酸脱羧酶基因oxdC使用NCBI网站BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST）进行序列比对分析，选取100%配对的pET28a-BaoxdC重组子，对应相应的克隆，将LB液体培养基于37 ℃、200 r/min过夜振荡培养，随后抽提重组质粒[12]。使用化学转化法将重组质粒pET28a-BaoxdC转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，于37 ℃、IPTG诱导下进行表达并纯化，方法如下：将含有pET28a-BaoxdC的BL21（DE3）菌株于 37 ℃ 下在LB液体培养基中过夜振荡培养，以菌液量与培养基体积比为1 ∶ 100的比例接种于LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡培养至D600 nm为0.6，此时加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，同时加入MnCl2至终浓度为6 mmol/L，于37 ℃、200 r/min条件下诱导表达10 h。随后5 000 g离心15 min收集菌体，弃去上清，菌体沉淀按照与培养液体积比为1 ∶ 10的比例，悬浮于含有0.5 mol/L NaC1的50 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH值7.6）中，于冰浴条件下使用超声波破碎仪进行细胞破碎，破碎条件：破碎1 s，暂停2 s，破碎总时间为8 min，功率为50%。破碎之后进行 4 ℃、10 000 g 离心30 min，然后将上清液转移至1个干净的EP管中，上清和沉淀分别取样，并用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并用考马斯亮蓝染色检测蛋白的表达情况[13]。

1.2.4 粗酶液蛋白浓度及酶活力的测定 蛋白浓度采用考马斯亮蓝法（Bradford法）蛋白浓度测定试剂盒测定。草酸脱羧酶活力检测参考Sasikumar等的方法[14]。于1.5 mL的反应体系之中，添加76 mmol/L草酸钠0.2 mL，50 mmol/L 柠檬酸缓冲液（pH值4.0）1.2 mL，在37 ℃温度下水浴2 min，加入草酸脱羧酶液0.1 mL开始反应，10 min后迅速加入等体积的0.2 mol/L磷酸氢二钾使体系的pH值快速上升至中性，从而终止反应;反应液使用0.22 μm微孔滤膜进行过滤，以草酸钠作为底物，以此测定草酸脱羧酶的活力，利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测反应生成的甲酸。色谱柱为Aminexresin-based 87H柱，柱温60 ℃，流动相为0.005 mol/L H2SO4，流速为0.5 mL/min;使用紫外检测器210 nm进行检测，进样量为20 μL。

首先制作甲酸标准品的浓度梯度，根据甲酸浓度与HPLC 210 nm处吸收峰面积的线性关系，以此来绘制标准曲线，然后利用Bradford法测定蛋白浓度。根据稀释的系列浓度梯度，绘制出蛋白标准品BSA的浓度与575 nm处吸光度的关系的标准曲线。根据绘制的标准曲线，分别计算出样品的甲酸浓度与蛋白浓度之间的线性比例关系。在测定粗酶液蛋白浓度时，稀释1倍之后再测定其吸光度，即实际蛋白浓度应加倍。定义酶活单位：1 min催化转化草酸产生 1 μmol 甲酸的酶量，以此来计算草酸脱羧酶酶活。由于破碎细胞时，细胞重悬后溶液体积过小，不利于破碎的进行，于是稀释1倍后进行破碎，所以离心后的菌体沉淀实际是按照液体培养基的20%进行重悬，故酶活应为10%重悬菌体沉淀的一半。酶的比活力即为单位质量（mg）酶所具有的酶活力单位数，酶活力与酶浓度之比即为草酸脱羧酶比活力，与酶液浓度无关，因此数据比较具有代表性。

1.2.5 诱导条件对重组草酸脱羧酶表达的影响 在液体培养基中，以体积比为1%的接种量进行接种，待D600 nm为0.6左右时，添加IPTG至终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，同时添加MnCl2至终浓度为0.6 mmol/L，诱导表达4 h，测定并计算酶活、比活力，得出最佳IPTG诱导浓度;在最佳IPTG诱导浓度条件下，分别设置时间梯度2、4、6、8 h，得出最佳IPTG诱导时间，以此来确定不同IPTG浓度与诱导时间对草酸脱羧酶表达量的影响。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌C（10） oxdC基因的克隆

以解淀粉芽孢杆菌C（10）为模板，使用特异性引物oxdC-F/oxdC-R扩增得到1 161 bp左右的oxdC基因目的片段（图1），该片段经测序并在NCBI网站使用BLAST功能与解淀粉芽孢杆菌DSM7的草酸脱羧酶基因（oxdC）进行比对，相似度为100%。

2.2 重组质粒pET28a-BaoxdC的酶切鉴定

使用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对重组质粒pET28a-BaoxdC进行双酶切，酶切产物经用琼脂糖凝胶进行检测，结果如图2所示。重组质粒pET28a-BaoxdC经酶切后出现一大一小2个片段，大片段与pET28a空载体大小基本吻合，小片段在1 200 bp左右，与目的产物1 161 bp相符合。结果酶切产物在1 200 bp处之下出现1条条带，符合目的产物 1 161 bp 的预期结果，而空载体pET28a（+）则无此条带，表明酶切结果正确（图2）。

2.3 pET28a-BaoxdC重组子转化大肠杆菌DH5α

pET28a-BaoxdC重组子转化大肠杆菌DH5α 37 ℃恒温培养14 h后，得到的单克隆菌落如图3所示。

2.4 转化子菌液PCR鉴定

取转化子单克隆菌落进行液体培养基试管振荡培养，随后取菌液作模板，以oxdC-F/oxdC-R为引物进行菌液PCR，结果如图4所示，有1个阳性克隆。

2.5 pET28a-BaoxdC重组子测序结果

将阳性克隆子所对应的菌液送北生物商贸有限公司进行测序，测序的结果与模板序列进行比对，结果显示该基因所表达的重组蛋白具有草酸脱羧酶活性。

2.6 诱导条件对重组草酸脱羧酶表达的影响

根据甲酸浓度与HPLC 210 nm处吸收峰面积的线性关系，绘制标准曲线（图5）。根据蛋白标准品BSA的不同浓度梯度与575 nm处吸光度的关系，绘制标准曲线（图6）。酶的比活力即为单位质量（mg）酶所具有的酶活力单位数，酶活力与酶浓度之比即为草酸脱羧酶比活力（表1）。

2.6.1 IPTG浓度对诱导表达的影响 由图7可知，当IPTG的诱导浓度为0.6 mmol/L时，酶活力和比活力最高，分别为3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg，说明此时的IPTG浓度为最适诱导浓度。当IPTG诱导浓度达到1 mmol/L时，可能是因为IPTG对大肠杆菌产生了明显的毒性，并且抑制了重组草酸脱羧酶的表达，因此酶活力及比活力大大降低。

2.6.2 诱导时间对诱导表达的影响 由图8可知，当IPTG诱导时间为4 h时，酶活力和比活力最高，分别为 3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg，说明4 h为最适诱导时间。

3 讨论

本试验通过对解淀粉芽孢杆菌草酸脱羧酶基因进行原核表达，并探究重组草酸脱羧酶的表达与IPTG诱导表达条件之间的关系。

来源于解淀粉芽孢杆菌C（10）的草酸脱羧酶基因oxdC经过PCR扩增并与载体pET28a构建了1个新的pET28a-BaoxdC重组子，并成功地转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌落PCR鉴定结果并测序检验后，证明该基因在原核表达系统得到稳定遗传。原核表达测序结果与解淀粉芽孢杆菌C（10）的草酸脱羧酶基因oxdC的序列进行比对之后发现，该基因所表达的重组蛋白仍具有草酸脱羧酶活力，因此可判断表达成功。

利用高效液相色谱法对反应生成的甲酸进行检测，以此寻找重组草酸脱羧酶的表达与IPTG诱导表达条件之间的关系。添加诱导剂IPTG和MnCl2对目标蛋白草酸脫羧酶的诱导合成显著。根据单因素梯度试验确定重组草酸脱羧酶最佳的诱导表达条件为：诱导时间4 h，添加IPTG至终浓度 0.6 mmol/L，MnCl2至终浓度6 mmol/L，此时酶活力和比活力最高，分别为3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg。试验结果表明，诱导时间与IPTG浓度是影响草酸脱羧酶表达的重要因素。

标准菌株解淀粉芽孢杆菌DSM 7全基因组已被解析出来，根据生物信息学分析，推测其中oxdC序列为草酸脱羧酶基因，但并未进行试验验证，同时也没有文献报道研究过解淀粉芽孢杆菌的草酸脱羧酶基因，本试验以NCBI上推测的解淀粉芽孢杆菌DSM 7草酸脱羧酶基因oxdC序列为目的基因，进行克隆表达、酶活测定，以鉴定其是否具有草酸脱羧酶活力，并测定粗酶活力，原核表达活力较高，可以进一步优化表达，纯化蛋白，并测量其酶学特性，挖掘其更多的应用价值。

参考文献：

[1]吴一晶，林艺芬，林河通，等. 生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展[J]. 包装与食品机械，2012（6）：49-52.

[2]杨胜远，韦 锦，李 云，等. 一株产抗菌活性物质解淀粉芽孢杆菌的筛选及鉴定[J]. 食品科学，2010，31（21）：208-212.

[3]Bajaj I，Singhal R.Poly（glutamic acid）-an emerging biopolymer of commercial interest[J]. Bioresource Technology，2011，102（10）：5551-5561.

[4]Ashiuchi M，Shimanouchi K，Nakamura H，et al. Enzymatic synthesis of high molecular masspoly gamma glutamate and regulation of its stereochemistry[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70（7）：4249-4255.

[5]Bovarnick M. The formation of extracellular D（—）glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis[J]. Biological Chemistry，1942（145）：415-424.

[6]Just V J，Stevenson C M，Bowater L，et al. A closed conformation of Bacillus subtilis oxalate decarboxylase Oxd C provides evidence for the true identity of the active site[J]. Journal of Biological Chemistry，2004，279（19）：19867-19874.

[7]贺俊斌，林日辉，韦成昱，等. 草酸脱羧酶的性质及应用研究进展[J]. 食品科学，2015，36（1）：262-267.

[8]赵树田，张士青. 草酸代谢酶的研究进展[J]. 上海交通大学学报（医学版），2007，27（10）：1274-1277.

[9]Cassland P，Sjode A，Winestrand S，et al. Evaluation of oxalate decarboxylase and oxalate oxidase for industrial applications[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，161（1/2/3/4/5/6/7/8）：255-263.

[10]Makela M R，Hilden K，Lundell T K. Oxalate decarboxylase：biotechnological update and prevalence of the enzyme in filamentous fungi[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87（3）：801-814.

[11]于俊杰，陈志谊，胡建坤，等. 枯草芽孢杆菌Bs-916草酸脱羧酶基因Bacisubin的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析[J]. 江苏农业学报，2012，28（3）：497-502.

[12]Twahir U T，Stedwell C N，Lee C T，et al. Observation of superoxide production during catalysis of Bacillus subtilis oxalate decarboxylase at pH 4[J]. Free Radical Biology and Medicine，2015，80：59-66.

[13]Sasikumar P，Gomathi S，Anbazhagan K，et al. Secretion of biologically active heterologous oxalate decarboxylase （OxdC） in Lactobacillus plantarum WCFS1 using homologous signal peptides[J/OL]. BioMed Research International，2013，2013：9（2013-07-18）. https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3732618/.

[14]Svedruzic D，Liu Y，Reinhardt L A，et al. Investigating the roles of putative active site residues in the oxalate decarboxylase from Bacillus subtilis[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，464（1）：36-47.申順先，李学慧，梁明勤，等. 丹参叶片离体培养体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学，2019，47（12）：70-73.