解淀粉芽孢杆菌草酸脱羧酶基因的克隆、原核表达与活力测定

2019-08-21 01:13白雪张慧莉黄冲
江苏农业科学 2019年12期
关键词:原核表达克隆

白雪 张慧莉 黄冲

摘要:为进一步明确解淀粉芽孢杆菌C(10)的草酸脱羧酶基因的生物功能,克隆其关键基因对该基因进行原核表达。通过PCR技术克隆了淀粉芽孢杆菌C(10)的草酸脱羧酶基因,构建了原核生物表达载体pET28a-Baoxdc,对其进行表达与纯化。结果表明,扩增所获解淀粉芽孢杆菌C(10)的草酸脱羧酶全基因序列全长为1 161 bp,在大肠杆菌中进行表达,添加诱导剂IPTG、MnCl2至终浓度分别为0.6、6 mmol/L,诱导4 h时的酶活力和比活力最高,分别为3.793 2 U/mL和3.145 3 U/mg。

关键词:解淀粉芽孢杆菌;草酸脱羧酶;克隆;原核表达;酶活测定

中图分类号: Q786;S188  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)12-0066-04

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为革兰氏阳性短杆菌,是一种好氧、嗜温并且产芽孢的杆状细菌[1]。它生长繁殖较快,可以利用的营养物质种类十分丰富,能够抗菌、消毒,可产生多种抗菌素和酶类,具有一定程度的广谱抗菌活性以及极强的抗逆性能,对人、畜无毒害作用[2]。

解淀粉芽孢杆菌的自身代谢产物中有一种重要的产物是γ-聚谷氨酸(poly-γ-glumatic,γ-PGA),它是自然界中的一些微生物(主要是芽孢杆菌属)合成的具有水溶性、可生物降解的阴离子型多聚氨基酸[3]。γ-聚谷氨酸拥有良好的吸水性、成膜性、絮凝性、成纤维性、阻氧性、可塑性以及黏结性,在食品工业、化妆品行业、菌种保藏及污水处理等方面具有广泛的用途[4]。自1942年Bovarnick等发现了芽孢杆菌可以在培养基中累积γ-PGA至今[5],对于使用微生物发酵法合成γ-PGA的研究就一直比较活跃。

经查阅相关文献,在解淀粉芽孢杆菌γ-PGA的代谢通路中有一种活性较高的草酸脱羧酶,它能将草酸转化为甲酸,从而降解为二氧化碳,而草酸是γ-PGA的刺激剂,能刺激细胞内γ-聚谷氨酸的高产。草酸(oxalic acid,OA)是自然界中酸性最强的有机二元羧酸,能溶于水和乙醇,通常由植物、微生物通过水解草酰乙酸或氧化乙醛酸、抗坏血酸产生[6]。草酸脱羧酶(oxalate decarboxylase,OXDC)是一种包含Mn2+的均一聚合酶,属Cupin蛋白超家族[7];它可在没有辅因子的条件下催化草酸转化为甲酸和CO2,是植物、微生物中草酸代谢降解的主要催化酶之一[8]。基于这一原理,本试验将对草酸脱羧酶基因进行原核表达,并初步探究诱导表达条件。

目前,标准菌株解淀粉芽孢杆菌DSM7全基因组已被解析出来,根据生物信息学分析,其中oxdC序列为草酸脱羧酶基因[9],但并未进行试验进行验证,同时也没有文献报道研究过解淀粉芽孢杆菌的草酸脱羧酶基因[10]。因此本试验重点阐述了来源于解淀粉芽孢杆菌C(10)的草酸脱羧酶基因oxdC经过克隆并构建新的重组载体,成功地转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并在原核表达系统中得到稳定遗传,根据单因素梯度试验确定了重组草酸脱羧酶最佳的诱导表达条件,这为草酸脱羧酶的相关后续试验奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 解淀粉芽孢杆菌C(10)(B. amyloliquefaciens)为笔者所在实验室保藏;大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和BL21分别由石河子大学生命科学学院黄先忠教授和崔百明教授惠赠;原核表达载体pET28a(+)由石河子大学生命科学学院李鸿彬教授惠赠。

1.1.2 试剂 酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限公司;胰化蛋白胨购自BBI;琼脂糖购自BIOWEST;Tris购自ICN;SDS购自Biotech;乙二胺四乙酸二钠购自Biosharp;限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司;2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;Kanamycine、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、硼酸均购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌C(10)oxdC基因的克隆 根据NCBI网站基因数据库中解淀粉芽孢杆菌DSM7的草酸脱羧酶oxdC的基因序列,设计1对特异引物:oxdC-F,5′-CGGGATCCATGTCAAAAGAAAACAACTGCAATATCCCGC-3′(下划线为BamH Ⅰ酶切位点);oxdC-R,5′-CCGCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACTGGATG-3′)(下划线为Xho Ⅰ酶切位点,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR的扩增,反应体系为2×Taq PCR Mastermix[其中包含0.1 U/μL Taq聚合酶、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl(pH值8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2以及其他稳定剂和增强剂]25 μL,模板1 μL(每个反应小于1 μg),正反向引物(10 μmol/L)各2 μL,加ddH2O补足50 μL。反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃ 5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶(浓度为1%)电泳分离、鉴定,根据marker片段比对扩增产物,确定扩增产物片段大小无误之后,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的片段进行割胶回收[11]。

1.2.2 重组质粒pET28a-BaoxdC的构建 回收后的PCR产物用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,同時用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对表达载体pET28a(+)进行双酶切,37 ℃酶切3 h后使用琼脂糖凝胶电泳分离并对酶切产物进行检测,正确条带经割胶回收检测纯化之后,对oxdC酶切产物与pET28a(+)酶切产物按摩尔比1 ∶ 4进行过夜连接,使用T4 DNA连接酶进行连接,16 ℃过夜,以此来构建pET28a-BaoxdC重组质粒。检测并纯化连接产物。

将酶切鉴定和序列测定后的重组质粒pET28a-BaoxdC使用常规化学转化法(CaCl2)法进行化学转化感受态细胞大肠杆菌DH5α,转化后的pET28a-BaoxdC重组子细胞涂布LB固体培养基平板,于37 ℃恒温培养12~16 h。

于平板上随机挑取10个边缘整齐、大小适中的转化子单克隆菌落,在装有15 mL LB液体培养基的试管中于37 ℃、200 r/min 振荡过夜培养,随后取菌液作为模板,以oxdC-F/oxdC-R作为引物进行菌液PCR,菌液PCR反应体系为2×Taq PCR Mastermix[其中包含0.1 U/μL Taq、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl(pH值8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2以及其他稳定剂和增强剂]25 μL,模板接触即可(每个反应小于1 μg),正反向引物(10 μmol/L)各 2 μL,加ddH2O补足至50 μL。反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,25个循环;72 ℃ 充分延伸5 min。菌液PCR结果由琼脂糖凝胶电泳分离并鉴定,最后选取2个阳性克隆子,菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 oxdC基因的原核表达及粗酶液的提取 将阳性克隆子的测序结果与NCBI基因组数据库中的解淀粉芽孢杆菌DSM7草酸脱羧酶基因oxdC使用NCBI网站BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST)进行序列比对分析,选取100%配对的pET28a-BaoxdC重组子,对应相应的克隆,将LB液体培养基于37 ℃、200 r/min过夜振荡培养,随后抽提重组质粒[12]。使用化学转化法将重组质粒pET28a-BaoxdC转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,于37 ℃、IPTG诱导下进行表达并纯化,方法如下:将含有pET28a-BaoxdC的BL21(DE3)菌株于 37 ℃ 下在LB液体培养基中过夜振荡培养,以菌液量与培养基体积比为1 ∶ 100的比例接种于LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min 振荡培养至D600 nm为0.6,此时加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L,同时加入MnCl2至终浓度为6 mmol/L,于37 ℃、200 r/min条件下诱导表达10 h。随后5 000 g离心15 min收集菌体,弃去上清,菌体沉淀按照与培养液体积比为1 ∶ 10的比例,悬浮于含有0.5 mol/L NaC1的50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH值7.6)中,于冰浴条件下使用超声波破碎仪进行细胞破碎,破碎条件:破碎1 s,暂停2 s,破碎总时间为8 min,功率为50%。破碎之后进行 4 ℃、10 000 g 离心30 min,然后将上清液转移至1个干净的EP管中,上清和沉淀分别取样,并用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,并用考马斯亮蓝染色检测蛋白的表达情况[13]。

1.2.4 粗酶液蛋白浓度及酶活力的测定 蛋白浓度采用考马斯亮蓝法(Bradford法)蛋白浓度测定试剂盒测定。草酸脱羧酶活力检测参考Sasikumar等的方法[14]。于1.5 mL的反应体系之中,添加76 mmol/L草酸钠0.2 mL,50 mmol/L 柠檬酸缓冲液(pH值4.0)1.2 mL,在37 ℃温度下水浴2 min,加入草酸脱羧酶液0.1 mL开始反应,10 min后迅速加入等体积的0.2 mol/L磷酸氢二钾使体系的pH值快速上升至中性,从而终止反应;反应液使用0.22 μm微孔滤膜进行过滤,以草酸钠作为底物,以此测定草酸脱羧酶的活力,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测反应生成的甲酸。色谱柱为Aminexresin-based 87H柱,柱温60 ℃,流动相为0.005 mol/L H2SO4,流速为0.5 mL/min;使用紫外检测器210 nm进行检测,进样量为20 μL。

首先制作甲酸标准品的浓度梯度,根据甲酸浓度与HPLC 210 nm处吸收峰面积的线性关系,以此来绘制标准曲线,然后利用Bradford法测定蛋白浓度。根据稀释的系列浓度梯度,绘制出蛋白标准品BSA的浓度与575 nm处吸光度的关系的标准曲线。根据绘制的标准曲线,分别计算出样品的甲酸浓度与蛋白浓度之间的线性比例关系。在测定粗酶液蛋白浓度时,稀释1倍之后再测定其吸光度,即实际蛋白浓度应加倍。定义酶活单位:1 min催化转化草酸产生 1 μmol 甲酸的酶量,以此来计算草酸脱羧酶酶活。由于破碎细胞时,细胞重悬后溶液体积过小,不利于破碎的进行,于是稀释1倍后进行破碎,所以离心后的菌体沉淀实际是按照液体培养基的20%进行重悬,故酶活应为10%重悬菌体沉淀的一半。酶的比活力即为单位质量(mg)酶所具有的酶活力单位数,酶活力与酶浓度之比即为草酸脱羧酶比活力,与酶液浓度无关,因此数据比较具有代表性。

1.2.5 诱导条件对重组草酸脱羧酶表达的影响 在液体培养基中,以体积比为1%的接种量进行接种,待D600 nm为0.6左右时,添加IPTG至终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L,同时添加MnCl2至终浓度为0.6 mmol/L,诱导表达4 h,测定并计算酶活、比活力,得出最佳IPTG诱导浓度;在最佳IPTG诱导浓度条件下,分别设置时间梯度2、4、6、8 h,得出最佳IPTG诱导时间,以此来确定不同IPTG浓度与诱导时间对草酸脱羧酶表达量的影响。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌C(10) oxdC基因的克隆

以解淀粉芽孢杆菌C(10)为模板,使用特异性引物oxdC-F/oxdC-R扩增得到1 161 bp左右的oxdC基因目的片段(图1),该片段经测序并在NCBI网站使用BLAST功能与解淀粉芽孢杆菌DSM7的草酸脱羧酶基因(oxdC)进行比对,相似度为100%。

2.2 重组质粒pET28a-BaoxdC的酶切鉴定

使用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对重组质粒pET28a-BaoxdC进行双酶切,酶切产物经用琼脂糖凝胶进行检测,结果如图2所示。重组质粒pET28a-BaoxdC经酶切后出现一大一小2个片段,大片段与pET28a空载体大小基本吻合,小片段在1 200 bp左右,与目的产物1 161 bp相符合。结果酶切产物在1 200 bp处之下出现1条条带,符合目的产物 1 161 bp 的预期结果,而空载体pET28a(+)则无此条带,表明酶切结果正确(图2)。

2.3 pET28a-BaoxdC重组子转化大肠杆菌DH5α

pET28a-BaoxdC重组子转化大肠杆菌DH5α 37 ℃恒温培养14 h后,得到的单克隆菌落如图3所示。

2.4 转化子菌液PCR鉴定

取转化子单克隆菌落进行液体培养基试管振荡培养,随后取菌液作模板,以oxdC-F/oxdC-R为引物进行菌液PCR,结果如图4所示,有1个阳性克隆。

2.5 pET28a-BaoxdC重组子测序结果

将阳性克隆子所对应的菌液送北生物商贸有限公司进行测序,测序的结果与模板序列进行比对,结果显示该基因所表达的重组蛋白具有草酸脱羧酶活性。

2.6 诱导条件对重组草酸脱羧酶表达的影响

根据甲酸浓度与HPLC 210 nm处吸收峰面积的线性关系,绘制标准曲线(图5)。根据蛋白标准品BSA的不同浓度梯度与575 nm处吸光度的关系,绘制标准曲线(图6)。酶的比活力即为单位质量(mg)酶所具有的酶活力单位数,酶活力与酶浓度之比即为草酸脱羧酶比活力(表1)。

2.6.1 IPTG浓度对诱导表达的影响 由图7可知,当IPTG的诱导浓度为0.6 mmol/L时,酶活力和比活力最高,分别为3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg,说明此时的IPTG浓度为最适诱导浓度。当IPTG诱导浓度达到1 mmol/L时,可能是因为IPTG对大肠杆菌产生了明显的毒性,并且抑制了重组草酸脱羧酶的表达,因此酶活力及比活力大大降低。

2.6.2 诱导时间对诱导表达的影响 由图8可知,当IPTG诱导时间为4 h时,酶活力和比活力最高,分别为 3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg,说明4 h为最适诱导时间。

3 讨论

本试验通过对解淀粉芽孢杆菌草酸脱羧酶基因进行原核表达,并探究重组草酸脱羧酶的表达与IPTG诱导表达条件之间的关系。

来源于解淀粉芽孢杆菌C(10)的草酸脱羧酶基因oxdC经过PCR扩增并与载体pET28a构建了1个新的pET28a-BaoxdC重组子,并成功地转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经菌落PCR鉴定结果并测序检验后,证明该基因在原核表达系统得到稳定遗传。原核表达测序结果与解淀粉芽孢杆菌C(10)的草酸脱羧酶基因oxdC的序列进行比对之后发现,该基因所表达的重组蛋白仍具有草酸脱羧酶活力,因此可判断表达成功。

利用高效液相色谱法对反应生成的甲酸进行检测,以此寻找重组草酸脱羧酶的表达与IPTG诱导表达条件之间的关系。添加诱导剂IPTG和MnCl2对目标蛋白草酸脫羧酶的诱导合成显著。根据单因素梯度试验确定重组草酸脱羧酶最佳的诱导表达条件为:诱导时间4 h,添加IPTG至终浓度 0.6 mmol/L,MnCl2至终浓度6 mmol/L,此时酶活力和比活力最高,分别为3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg。试验结果表明,诱导时间与IPTG浓度是影响草酸脱羧酶表达的重要因素。

标准菌株解淀粉芽孢杆菌DSM 7全基因组已被解析出来,根据生物信息学分析,推测其中oxdC序列为草酸脱羧酶基因,但并未进行试验验证,同时也没有文献报道研究过解淀粉芽孢杆菌的草酸脱羧酶基因,本试验以NCBI上推测的解淀粉芽孢杆菌DSM 7草酸脱羧酶基因oxdC序列为目的基因,进行克隆表达、酶活测定,以鉴定其是否具有草酸脱羧酶活力,并测定粗酶活力,原核表达活力较高,可以进一步优化表达,纯化蛋白,并测量其酶学特性,挖掘其更多的应用价值。

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