核桃叶片愈伤组织的诱导及植株再生研究

戴小云 武春霞

摘  要：以杂种核桃组培苗的叶片和叶柄为材料，设置5种激素组合进行叶片和叶柄愈伤组织的诱导，并设置4种激素组合进行愈伤组织再分化的诱导，以研究杂种核桃的组培再生技术。结果表明：叶柄较叶片更容易发生愈伤组织，并且褐化率较低;TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1 2种植物激素组合最适合愈伤组织的诱导。产生的愈伤组织呈白色和黄白色，为非胚性愈伤组织。在4种激素组合下愈伤组织器官，但均未诱导成功。部分愈伤组织有增殖，培养1个月后全部褐化。研究说明杂种核桃的愈伤组织较容易诱导发生，而器官的再分化较困难。

关键词：核桃;愈伤组织;植物激素;植株再生

中图分类号 S662文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）13-0044-04

Abstract：In order to study the tissue culture regeneration technology of hybrid walnut，in this study we used the leaves and petioles of hybrid walnut tissue culture seedlings as materials，and 5 hormone combinations were set to induce callus of leaves and petioles. In addition，4 hormone combinations were set to induce callus redifferentiation. The results showed that the petioles was more easy to induce callus than leaves，and the browning rate was lower. We found two hormone combinations which TDZ4mg·L-1+2，4-D1.5mg·L-1 and 6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1 were the most suitable for callus induction. The callus induced was white and yellowish white，but it was non-embryonic callus. Organ induction from callus was all not successful under the combinations of 4 hormones. Some of the callus proliferated and all browned after cultured one month. It showed that callus of hybrid walnut was easy to induce，but the redifferentiation of organs was difficult. The results of this study laid a certain foundation for further study on walnut callus organ differentiation.

Key words：Walnut;Callus;Phytohormone;Plant Regeneration

1 前言

核桃（Juglan regia L.）屬胡桃科核桃属的落叶高大乔木，因其核仁营养丰富，风味独特和用途多样而跻身于世界四大干果之一。核桃具有较高的经济价值，除核仁可食用外，其全株各个部分都各有用途[1-3]，因而成为农民脱贫致富的主要经济树种，也是我国粮油的战略储备树种，具有良好的发展前景。

植物组织培养是重要的生物技术之一，在植物的快速繁殖、资源的离体保护等方面已广泛应用。植物组织培养在植物生物技术中占据着核心位置，通过植物组织培养还可以实现植株的再生。目前已在多种植物上获得成功，如柚木、枣树、蓝莓等[4-6]，为植物基因工程遗传转化及优良无性系的快速繁殖研究奠定了基础。自上世纪60年代末，世界各地开始了核桃组织培养技术的研究。1969年，美国的Cummins等首次诱导黑核桃（Juglans nigra）茎段获得了愈伤组织，然而并未得到分化的器官。1981年，Chalupa以改良的MS为基本培养基，首次报道了以核桃实生苗茎段作为外植体的完整植株形成过程[7]。我国关于核桃组织培养的相关研究开始较晚，直到1986年，袁巧平等以核桃腋芽作为外植体，重点研究了植物激素条件对诱导核桃形成完整植株的影响[8]。汤浩茹等在2000年采用核桃的幼胚胚轴和子叶作为外植体，成功的诱导出了体细胞胚和完整的植株[9]。然而，该技术难度较大，取材时期要求较严格、污染较高、外植体易褐化，并且较难分化、容易发生退化现象、增殖速率不高、生根困难，这一系列的问题一直都没能得到很好的解决。核桃组培苗无菌，叶片数量较大，容易获得，因此是良好的外植体材料。关于叶片愈伤组织的诱导，目前已有报道，李好先、张燕等分别以绿波核桃和汾阳核桃叶片为试材，进行了愈伤组织的诱导[10，11]。然而，关于核桃叶片诱导植株再生的研究，目前还比较少，并且比较困难。

在植物组织培养中，植物激素是重要的调节剂。生长素和细胞分裂素尤为重要，在愈伤组织的诱导和器官的分化中起着重要的调节作用。不同激素种类及浓度的组合所产生的作用效果截然不同。一般当生长素浓度相对细胞分裂素浓度高时有利于组培苗根的分化，反之则利于不定芽的形成。Heile-Sudholt等在以黑核桃的胚轴和实生苗茎尖为外植体的诱导研究中发现胚根、上胚轴、不定芽及愈伤组织诱导在很大程度上受到6-BA浓度的影响，且6-BA能刺激愈伤组织的形成[12]。TDZ是活性较高的细胞分裂素类物质，李好先等采用绿波核桃叶片作为外植体，研究结果表明较低浓度的TDZ（2.0～4.0mg·L-1）对叶片愈伤组织的形成具有促进作用;高浓度（8.0～10.0mg·L-1）则作用相反，同时对叶片和愈伤组织的褐化有抑制作用，使形成的愈伤组织比较疏松。生长素在愈伤组织的形成中也具有重要的作用，研究发现低浓度的IBA（0.01～0.5mg·L-1）对叶片愈伤组织的形成是有利的，高浓度的IBA（>1.0mg·L-1）则抑制愈伤组织的形成[13]。由此可见，同种植物激素的不同类型在组织培养中的作用和对于不同的材料植物激素所起的作用都存在一定的差异。

本研究以杂种核桃为试材，该种核桃生长旺盛，可以作为良好的砧木，研究其无性化繁殖对核桃的良种化和一致性具有重要的意义。因此，我们以该种核桃叶片为外植体，利用不同组合的生长素和细胞分裂素，筛选适宜核桃愈伤组织诱导及器官分化的最佳组合，为核桃的遗传转化研究及无性系的快速繁殖奠定基础。

2 材料与方法

2.1 试验材料 试验以天津农学院东校区杂种核桃树为试验材料。

2.2 试验方法

2.2.1 无菌体系的建立 选择在晴天采集健康无损伤的核桃嫩枝带回实验室。去掉叶柄，留下1段小叶柄。用软刷蘸取洗洁精刷洗嫩枝，并置于流水冲洗2～3h。之后用0.3%的过氧乙酸进行消毒处理，处理2次，每次5min，然后用无菌水漂洗3～4次。分割成1芽1段接种于培养基中进行培养。

2.2.2 叶片和叶柄愈伤组织的诱导 取无菌苗中上部叶片为试材，将叶片切分成1cm×1cm的小块，接种于愈伤组织诱导培养基上，以MS为基础培养基，设置5种激素配比，分别为6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（处理1），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（处理2），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1（處理3），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（处理4），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（处理5）。

2.2.3 愈伤组织器官分化诱导 将诱导产生的愈伤组织切分成1cm×1cm的小块，接种于器官分化诱导培养基上，以MS为基础培养基，设置4种激素配比6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（处理6），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（处理7），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（处理8），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（处理9）。

3 结果与分析

3.1 不同激素组合对叶片愈伤组织形成的影响 从表1中可以看出，处理1和处理3愈伤组织发生量最多，并且处理3的叶片褐化数最少;处理5的效果最差，愈伤组织发生量最少，只有3个愈伤组织形成且较小。由于接种后置于黑暗条件培养，产生的愈伤组织主要呈黄白色或白色。

从图1中可以看出，愈伤组织发生率由高到低依次为处理1>处理3>处理4>处理2>处理5，处理1、处理3和处理4之间差异不明显，处理5与其他处理之间有明显的差异，并且其褐化也较明显。综合比较处理3最适合核桃叶片愈伤组织的诱导。

3.2 不同部位对愈伤组织发生的影响 本试验分别以叶片和叶柄为材料进行了愈伤组织的诱导。从表2中可以看出，整体上各个处理下叶柄愈伤组织的发生量大于叶片愈伤组织的发生量，尤其在处理3和处理4诱导下叶柄的愈伤组织发生量最大，并且在处理4下叶柄愈伤组织的发生率达到100%。

由图2可见，叶柄总的愈伤组织发生率明显高于叶片愈伤组织的发生，愈伤组织平均出愈率为67%;而褐化率刚好相反，叶柄的褐化率明显低于叶片的褐化率，叶柄平均褐化率为17%。说明叶柄比叶片更容易产生愈伤组织，并且不易发生褐化。

3.3 不同激素组合对愈伤组织器官分化的影响 本试验分别以叶片和叶柄产生的愈伤组织，在4种激素组合下进行了再分化的诱导。于诱导后的15d和30d分别进行观察。从表3中可以看出，诱导后的15d处理6和处理8仍有部分未褐化，处理7和处理9已全部褐化。处理8愈伤组织有明显的增殖，颜色转为绿色。其他处理的愈伤组织也有不同程度的变绿现象，处理6中愈伤组织表面出现白色粉状物，没有发现器官的分化。到诱导的30d时，所有处理的愈伤组织全部发生褐化，并且褐化明显加重。处理6和处理8的愈伤组织有明显的增殖，褐色部分增多，在愈伤组织的中部仍呈绿色。处理9的褐化程度最重，颜色呈黑褐色，仍未见器官的分化。

从表4可以看出，在诱导后的15d，处理7、处理8和处理9都有部分未褐化，尤其处理8和处理9未褐化数量较多，处理8愈伤组织呈绿白色，处理9愈伤组织呈黄白色至浅绿色。处理7愈伤组织大部分褐化，并且愈伤组织上部出现水浸状。各处理均为出现器官的分化。诱导后30d时，只有处理8为全部发生褐化，愈伤组织中部呈绿色，较松散。处理6的愈伤组织没有明显增殖，全部褐化呈黑色。处理9的愈伤组织仍有大部分呈绿色，但上部发生褐化较严重。所有的处理都没有产生器官的分化。

4 结论

以叶片和叶柄作为材料诱导愈伤组织，叶柄比叶片更容易产生愈伤组织。综合愈伤组织发生率及褐化率，在植物激素TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1的条件下，最利于叶片愈伤组织的形成。在植物激素TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1的条件下，最利于叶柄愈伤组织的形成。在这5种激素组合诱导下形成的愈伤组织都是非胚性愈伤组织。在6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（处理6），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（处理7），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（处理8），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（处理9）4种激素处理下，叶片及叶柄产生的愈伤组织均未发生器官的分化。

参考文献

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（责编：杨 林）