一种猪圆环病毒2型间接Elisa的建立

王 睿 程 平

(1.四川大学生物治疗国家重点实验室,四川成都 610041;2.中牧实业股份有限公司成都药械厂,四川成都 610100)

猪圆环病毒2型（PCV2）由Ellis等（1998）首次从断奶后多系统衰竭综合症（PMWS）病猪体内分离到，属于圆环病毒科，圆环病毒属成员，已证明是PMWS发生的必要病原。目前，我国猪圆环病毒2型市售疫苗主要以灭活全病毒疫苗为主，表达蛋白疫苗也在逐渐增多。在对其疫苗效力进行评价时，常采用免疫动物，采集血清，通过测定血清抗体效价的方法进行。目前，市场上有很多检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，不同厂家的试剂盒其成分均有差别，对同一样本的评价也是高低不一。因此，使用市售Elisa试剂盒对不同厂家疫苗进行评价，很难有一个清楚的结果。因此，我们尝试建立一种适合于经灭活疫苗免疫的猪血清抗体检测的间接Elisa，为我厂疫苗产品的改进优化提供较为可靠的数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

猪圆环病毒2型Cap蛋白由中牧研究院表达制备；酶标板，购自Thermo公司；牛血清白蛋白（BSA），购自Amresco公司；酪蛋白，购自Sigma公司；HRP标记羊抗猪酶标二抗购自KPL公司；可溶型单组分TMP底物溶液、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒均购自TIANGEN公司。

1.2 猪圆环病毒2型抗体阳性对照血清和阴性对照血清制备

猪圆环病毒2型抗体阳性对照血清，采用猪圆环病毒2型灭活疫苗，以1头份/头的剂量免疫2月龄无猪圆环病毒2型抗体的仔猪，21d后以2头份/头的剂量重复免疫，14d后颈动脉采血，无菌分离血清。阴性对照血清为2月龄无猪圆环病毒2型抗体仔猪，前腔静脉采血，分离血清。

1.3 封闭溶液的选择

1.3.1 空白封闭实验

将BSA、脱脂奶粉、鸡血清、羊血清、兔血清、酪蛋白，用0.01M PBS配置为浓度为5%的封闭液，每种加两孔，每孔300μl。同时设一列无封闭对照组，每孔加入300μ0.01M PBS，37℃封闭2h。用PBST洗板1次，将1：50倍稀释的阳性血清及阴性血清加入反应板，每孔加入100μl，37℃反应1h。用PBST洗涤3次，每孔加入100μl工作浓度的HRP标记羊抗猪二抗，37℃反应1h。用PBST洗涤3次，每孔加入TMB显色液100μL，避光显色15min，每孔加入100μl终止液，于450nm处读取OD值。

1.3.2 Western Blot定性检测实验

将BSA、脱脂奶粉、鸡血清、羊血清、兔血清、酪蛋白溶液，经12% SDS PAGE电泳，100v电转移至孔径为0.45μm孔径的硝酸纤维素膜，经TBST漂洗3次，加入经稀释的猪圆环病毒2型抗体阳性对照血清，4℃过夜，经TBST漂洗3次，加入工作浓度的HRP标记羊抗猪酶标二抗，室温作用1h，经TBST漂洗3次，用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色5min，用纯化水冲洗终止显色，拍照。

1.4 抗原最佳包被浓度的确定

采用棋盘滴定法。将Cap蛋白在酶标板上从左到右按照10、5、4、3、2、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1μg/ml浓度稀释，最后一列作为空白对照，每孔100μl，4℃放置过夜。用PBST洗板1次，每孔加入5%酪蛋白，37℃封闭2h。将阳性血清和阴性血清做1：50稀释，每个包被浓度加6孔经稀释的阳性血清和2孔经稀释的阴性血清，每孔100μl，37℃作用1h，用PBST洗板3次，每孔加入经说明书推荐稀释的HRP标记羊抗猪酶标二抗，37℃作用1h，用PBST洗板3次，每孔加入可溶型单组分TMP底物溶液100μl，避光显色15min，每孔加入100μl终止液，于450nm处读取OD值。分别计算各包被浓度的阳性平均值P和阴性平均值N，以包被浓度为横坐标，分别以P-N和P/N为纵坐标做图，选择P-N平台期内P/N最大的点为最佳包被浓度。

1.5 最佳封闭液浓度的确定

将Cap蛋白按0.3μg/ml包被后，将封闭液酪蛋白按5%、4%、3%、2%、1%、0%浓度封闭，将阳性血清按1：50稀释后进行Elisa检测，分别计算各封闭浓度的阳性平均值Pn，以封闭液浓度为横坐标、以Pn/P0为纵坐标做图，选择Pn/P0最小的最低酪蛋白浓度为最佳封闭液浓度。

1.6 酶标二抗最适工作浓度的确定

在酶标二抗推荐使用浓度的范围内，对酶标二抗浓度进行进一步摸索，寻找一个适用于本方法的最佳稀释度。将酶标二抗进行500倍、1000倍、2000倍、4000倍稀释，选取P/N值最高的作为最适工作浓度。

1.7 猪圆环病毒2型抗体间接Elisa检测方法临界值的确定

田间采集经猪圆环病毒2型疫苗免疫猪血清177份和115份未免疫的猪圆环病毒2型抗体阴性猪血清。用建立的猪圆环病毒2型抗体间接Elisa检测方法进行检测。利用SPSS软件对所有血清的OD值进行数据分析[1-4]。以敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，绘制ROC曲线，曲线每个点代表每个临界值对应的敏感性和特异性。计算每个临界值的Youden指数，选择Youden指数最大的OD值为临界值。

1.8 特异性实验

采集PRV、PPV、PRRSV、CSFV阳性猪血清，经病毒中和试验检验猪圆环病毒2型抗体为阴性后，用建立的间接Elisa方法对上述血清进行检验，判断是否具有交叉反应。

1.9 Elisa检测结果可比性验证

将阳性血清用阴性血清自1：25开始，做2倍梯度稀释，得到12个不同的阳性血清：SC1、SC2、SC3、SC4、SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12，将这些阳性血清用血清稀释液做2倍梯度稀释，做8个稀释度，用建立的猪圆环病毒2型抗体间接Elisa检测方法进行检测。将检测结果以1/稀释度为横坐标，以OD值为纵坐标作图，以验证该方法是否适用于比较经免疫后的血清抗体水平。

2 结果

（1）空白封闭结果（表1）显示，BSA、脱脂奶粉、羊血清、兔血清均会和经疫苗免疫制备的阳性血清发生反应，鸡血清和酪蛋白与阳性血清无明显反应；经Western Blot验证（图1），在膜未封闭的情况下，背景为黑色，BSA、羊血清、兔血清均存在与免疫血清反应的情况，为浅灰色条带，脱脂奶粉、鸡血清有部分灰色条带和部分明亮白色条带，酪蛋白基本不与血清无反应，为明亮的白色条带；结合两个结果，鸡血清和酪蛋白对Elisa结果干扰均较小，综合考察选择酪蛋白溶液作为封闭液。

表1

图1

（2）根据抗原包被浓度变化，P-N（图2）在10μg至0.3μg基本没有变化，而P/N（图3）在逐渐升高，综合考虑，抗原最佳包被浓度为0.3μg/ml。

图2

图3

（3）根据不同浓度封闭液的Pn/P0（图4），最适酪蛋白封闭液浓度为3%。

图4

（4）根据不同浓度酶标二抗P/N值，最适稀释度为1：1000

图5

（5）通过检测阴阳性血清，得到的OD450值经SPSS软件进行数据分析，计算敏感度和特异性（图6），得到Youden指数最大值为0.994，对应临界值为0.2985，选择近似值0.300为临界值。

图6

（6）通过对PRV、PPV、PRRSV、CSFV阳性猪血清检测，所有阳性血清均为阴性反应，说明建立的Elisa检测与上述猪常见疾病无交叉反应。

（7）以1/稀释度为横坐标，以OD值为纵坐标作图（图7），显示，该Elisa方法适合用于比较血清抗体水平。

图7

3 讨论

关于间接Elisa方法检测猪圆环病毒2型抗体的的报道极多，但少有针对经疫苗免疫血清抗体水平检测的，本方法的建立是有意义的。但如何将检测结果转化为可量化的数据，还需要建立更为适合的数据处理方法。