家畜精液冷冻保存技术的分析

石凯文 张晓菊

(1.安阳市动物疫病预防控制中心,河南安阳 455000;

2.安阳市生态环境局殷都分局,河南安阳 455000)

1 冷冻前精液预处理

通常，水浴平衡法是精子进行冷冻前的惯用的保护精子的方法，首先让精子有一定的时间用来适应较低的温度，不让精子出现大量的损伤；在这个过程中，精子自身可以改变细胞质和细胞膜的结构，同时可以让防冻剂进入细胞内，这两种方式均可以使得精子在低温的环境里有所适应。

降温和平衡是两个不同的环节，但又存在着紧密的联系。严格意义上讲，不同的降温时期，它的降温速度是不可能相同的，12℃是分界点，之前的温度下降十分缓慢，高于此温度下降迅速。

为了使精液的温度迅速下降到平衡时的温度，我们需要在不同时期调节冷冻的方法，使之达到加快降温的目的。

当降温结束后，精液稀释液要进入平衡阶段，过快和过慢的降温都不利于平衡阶段的开始，对精子的保护作用达不到预期的效果。

2 稀释液的配制

在对冻精研究时，稀释液是不可忽视的研究方面。生产稀释液的快速化，商品化，可以大力的推广人工受精和提高母畜的产仔率。

给精子提供必要的能量，预防过低温度对它的损害，创造合适的生存环境等方面稀释液有着不可替代的作用，它不但让精液的容积得到了大幅增加，同时增加了母畜生产更多幼畜的概率，还能使得一些危害精子的病菌难以生存。

很多年来一直在使用所熟知的稀释液的配方，没有研发新的组分和试剂配伍，使得我国在这一方面落后于很多开发新配方的国家，稀释液的成分的组成是影响精子冷冻效果的最直接因素之一，相比于其他因素，改变其组分和比例更能快速地提高精子冷冻，以及精子解除冷冻后的活力。正因为有很多我们熟知的因素可以影响到稀释液的质量和效果，所以我们发展稀释液的潜力非常巨大。

精液在保存的过程中，稀释液种类的不同，所产生的保护效果也不尽相同，随着时代的发展稀释液的组分的成分比例也在不停的改善，稀释液从原来的结构成分单一到生产复杂，组分繁多，再变成简单、便捷。

例如，在牛、狗的精子冷冻保存里使用基于Tris-Citric acid类的稀释液较普遍；在非人灵长类动物和羊的冻精中，经常采用Tris-Tes类的稀释液；虽然已有文献记载了一些稀释液的配伍和组分比例以及它们在实际生产中应用，但是，经验性和实验性仍然是哺乳动物精子冷冻保存的主流。

除了表1中所例举的稀释液种类外，还有很多稀释液在对哺乳动物精液的保存中得到了广泛的使用，它是决定冻精解冻后活力和母畜受孕率的重要的因素之一。

3 防冻剂

防冻剂的选择是关系到冷冻精子解冻后活力的重要步骤，二十一世纪后，已有很多渗透性防冻剂进入了生产环节，例如，甘油和胺类。

具有渗透功能的防冻剂在保护精子低温耐受方面表现的极为出色，甘油除此功能外还有稀释稀释液的能力，更好的降低了冷冻液中盐的解析，有学者指出，当甘油浓度达到6%～8%时，冷冻效果最为明显，解冻后精子的活力也最强。当甘油浓度继续上升时，冷冻精子复苏后的活力会越来越低，这是由于甘油的毒性所致。

为了降低甘油的毒性，人们首先发现这种毒害作用不是一成不变的，当在30℃时，精子的活力将很快的丧失；当在20℃时，要通过数小时后，甘油的毒性才能表现出来；当10℃时，精子的活力才会有轻微的下降。

研究者证明添加甘油的稀释液使母畜有良好的受胎率应该在5℃时进行，与此同时，为了尽可能减小甘油的毒作用，可以先将精液稀释一次，添加甘油再稀释一次这样的方法来降低甘油的危害精子的能力。

有研究说明甘油的最适浓度由稀释液的渗透压来决定，同时与卵黄的含量呈负相关，同时，降温速度100℃/min时，效果最优。

我们常见的防冻剂可以分为两大类，如表2所示：介于防冻剂去除后，稀释液中渗透压的会产生很大的变化，这样对细胞容易造成伤害。可以考虑采用多个步骤去除精液中的防冻剂，这样有利精子适应新的环境，提高它解冻后的复苏率和母畜的受胎。

表2 防冻剂的种类