应用实时荧光定量PCR 法检测仔猪肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌

吴苏君，罗惠娣，赵 娟

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

仔猪的死亡率占整个生长阶段死亡率的85%左右[1]，其病因及治疗研究已成为商业猪生产中一个新的研究热点。有研究表明，仔猪死亡的一个主要病因为腹泻。仔猪生长发育速度快，营养物质代谢旺盛，但其消化道发育不完善，先天性免疫能力较低，其免疫功能和肠道微生物的平衡易遭到破坏，从而导致动物感染和腹泻的发生率升高[2]。仔猪肠道中有很多种类的菌群，它们共同形成一个关系到宿主免疫、代谢及营养等多方面的微生态系统，影响着宿主健康[3]。研究发现，腹泻仔猪会出现肠道菌群微生态平衡失调，进而推测其腹泻的发生与肠道菌群失调存在一定联系。乳酸杆菌和双歧杆菌数量作为反映机体肠道健康的“晴雨表”，研究其数量变化具有极其重要的指示意义。粪便作为宿主和肠道菌群的共代谢产物，很大程度上可反映肠道菌群状态[3]。

本研究对1 月龄腹泻仔猪及正常仔猪粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌进行定量分析，比较仔猪肠道内这2 种细菌的数量，揭示其与腹泻症状的联系，为下一阶段开展肠道菌群与疾病症状的相关性研究搭建平台，为肠道菌群种类、数量变化的相关研究提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 研究对象 供试样本取自山西省天禄丰种猪场。取1 月龄断奶仔猪粪便，出现腹泻症状组30 例，正常对照组30 例。粪便样本用无菌管收集后置于-80 ℃保存。

1.1.2 主要试剂 QIAamp DNA Stool Mini Kit 购自Qiagen 公司；TransStart Probe qPCR SuperMix 购自北京全式金公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自北京TIANGEN 公司等。

1.1.3 主要仪器 Rotor-Gene Q PCR 仪，德国QIAGEN 公司；2-16PK 型高速低温离心机，Sigma（德国）公司；AL104-IC 电子天平，METTLER TOLEDO（上海）有限公司；1-14 型高速离心机，Eppendorf（德国）公司；MO6-063 摩尔基因型超纯水机，上海摩勒生物科技有限公司；微量移液器，Eppenderf 公司；立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-SⅡ型，上海博讯实业有限公司；101-2-BS-Ⅱ型电热恒温鼓风干燥箱，上海联进医疗器械厂；超低温冰箱，中科美菱公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样本DNA 提取 根据QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒中操作说明进行操作，提取样本中粪便细菌基因组DNA，逐一检测所提基因组浓度，样本于-20 ℃冰箱储存。

1.2.2 引物的设计与合成 在NCBI 中查找乳酸杆菌和双歧杆菌16S rRNA 序列，使用软件DNA MAN对比找出序列的同源性，进而发现乳酸杆菌和双歧杆菌的16S rRNA 基因保守区。依据其16S rRNA 特异性基因序列并参照国外文献，利用引物设计软件Primer Premier 6 设计乳酸杆菌和双歧杆菌种属特异性探针及引物，将设计出的引物通过NCBI 中BLAST 与基因库内其他序列比对，确定引物和探针序列具有特异性。探针及引物均由上海生工生物技术有限公司合成。实时荧光定量PCR 引物及探针序列如表1 所示。

表1 实时荧光定量PCR 引物及探针序列

1.2.3 标准曲线的制作 取正常对照组粪便基因组DNA 分别用乳酸杆菌和双歧杆菌上下游引物进行扩增，切下扩增产物，依照DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒操作说明进行回收纯化，分别测定回收产物的A 值（拷贝数/μL）及浓度，并分别换算为1 μL的标准品拷贝数来制作标准曲线。

1.2.4 实时荧光定量PCR 反应 取待测粪便样品中提取的DNA 作为模板，进行乳酸杆菌和双歧杆菌16S rDNA 实时荧光定量PCR 反应，试验所用反应体系列于表2，试验所用反应条件列于表3。试验中使用ddH2O 代替DNA 模板作为阴性对照，同时进行标准品校正，由Rotor-Gene Q PCR 仪分析定量结果。

表2 实时荧光定量PCR 反应体系

表3 实时荧光定量PCR 反应条件

1.3 数据分析

样本定量数据经对数转换后以均值±标准差（x±s）表示，数据分析使用SPSS 21.0 软件进行，用成组t 检验对两组间进行比较，P≤0.05 为差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

以不同拷贝数的标准品经对数转换后的拷贝数为横坐标，以定量PCR 反应过程中达到荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标，分别绘制2 种细菌的标准曲线，作为定量检测的参照标准（图1）。

2.2 实时荧光定量PCR 扩增分析

对正常对照组和出现腹泻症状组粪便中的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量进行定量分析，Ct 值用于表示管内荧光信号到达特定的域值时所经历的循环数（图2）。

由图2 可知，出现腹泻症状组粪便中的乳酸杆菌和双歧杆菌样本本身所含的mRNA 的量少，即出现腹泻症状组粪便中的乳酸杆菌和双歧杆菌数量较正常对照组减少。

2.3 粪便细菌定量检测结果

从表4 可以看出，出现腹泻症状组粪便中的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量明显少于正常对照组（P＜0.05）。

表4 粪便标本细菌定量检测结果 拷贝数/g

3 结论与讨论

作为宿主体内的肠道原籍菌群，它们作用非常重要：参与营养物质代谢过程、维护肠道上皮细胞健康、通过保护肠道黏膜来防御致病菌的侵害[4]以及利用菌体、代谢产物等激活免疫细胞、使得免疫系统发育成熟，从而被认为是畜禽重要的代谢和免疫器官[5-6]。这些细菌与机体形成了一种共生关系，其相互间的数量、比例在一定范围内上下波动，但在健康畜禽体内保持相对稳定，呈现动态平衡。而这种平衡受到多种因素的影响，一旦肠道菌群的数量、种类失调，平衡关系被破坏，就会有相应的疾病发生、发展。乳酸杆菌和双歧杆菌作为有益原籍菌群，在动物肠道内广泛定植，其通过分泌代谢产物、竞争排斥、形成保护膜抵抗病原微生物[7]、免疫调节等多种方式来发挥益生作用，以维持肠道微生物平衡及机体健康[8-9]，尤其对幼年畜禽，还可促进消化道发育成熟[10]，加快生长速度[11]。

据报道，我国约有80%的猪场中有仔猪表现出腹泻的临床症状，这一发病率达40%，腹泻造成的死亡使集约化养猪行业蒙受极大的经济损失[12]。本试验正是考虑到腹泻对养猪业的影响，在查阅大量相关文献后，计划运用实时荧光定量PCR 技术来检测腹泻仔猪粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌数量的变化[13]，以期发现腹泻与这2 种原籍菌是否存在联系。

本研究通过实时荧光定量PCR 法对仔猪肠道中的乳酸杆菌和双歧杆菌进行定量分析，结果表明，腹泻仔猪与健康仔猪相比，其粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著减少，表明仔猪腹泻的发病可能与肠道菌群的数量改变相关。

MACK 等[14]研究表明，乳酸杆菌能通过改变肠道分泌的黏液成分及性状来阻止病菌附着在肠壁上。尤其当抗原侵袭幼龄动物时，乳酸杆菌对于炎症反应等免疫过程的发生非常重要[15]。DEITCH 等[16]研究发现，乳酸杆菌在越过肠黏膜后，可刺激脾脏及其他器官中吞噬细胞的活性，激活免疫。WREN[17]研究表明，乳酸杆菌可以产生过氧化氢，抑制许多细菌的生长，进而减少仔猪腹泻、鸡白痢的发生率，提高动物生产性能。章文明[5]提出在仔猪饲养过程中，添加乳酸杆菌能有效预防仔猪腹泻。TANABE等[18]研究表明，双歧杆菌能通过抑制促炎因子IL-17在小鼠脾细胞中生成来缓解其肠道炎症，减少腹泻造成的损伤。邢爽等[19]研究发现，乳酸杆菌还能促进肠道上皮细胞紧密连接蛋白的表达和合理分布，维持并改善上皮细胞的屏障功能。双歧杆菌作为一种重要的益生菌，其在肠道内的数量既可表示宿主肠道微生态平衡状态，还可反映机体的健康状况[20]。张吉鹍[21]研究发现，双歧杆菌可将结合胆酸分解为抑菌杀菌功效更强的游离胆酸。DONG 等[22]研究指出，新生大鼠位于肠道中的双歧杆菌可以促使该部位树突状细胞（DC）的成熟，并促进T 细胞在胸腺中的发育。刘国荣等[23]研究发现，当双歧杆菌到达一定数量时，可以产生一种高效广谱细菌素。因此，双歧杆菌不单能提高免疫、抗衰老、抗肿瘤，还能合成多种维生素、细菌素，通过拮抗、抑制和营养等作用调整肠道菌群平衡，促进机体免疫机能[24]。这些研究表明，乳酸杆菌和双歧杆菌作为动物肠道内重要的原籍菌群，具有维持体内微生态平衡、发挥生物拮抗、进行免疫调节、参与营养代谢等方面的作用，当其数量发生变化时，会使得动物机体内原籍菌群数量和比例相应发生变化，动态平衡被破坏，从而导致机体的物质代谢、营养转化和合成发生障碍，可能引发动物腹泻。这与本试验的研究结果一致。

本研究发现，腹泻仔猪粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌的细菌数量明显减少，表明肠道菌种及其数量与仔猪腹泻的发病密切相关，提示喂饲乳酸杆菌和双歧杆菌可能成为改善肠道菌群失调、维护肠屏障功能的新途径，为仔猪腹泻的微生态靶向治疗提供一定的依据，但是需要今后在干预研究中进一步验证。