基于ISSR-PCR分子标记的黑木耳遗传多样性分析

李 红 ，张 敏 *，屈 麟 ，刘国丽 ，刘岩岩

（1.辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳 110161；

2.沈阳工学院生命工程学院，辽宁沈阳 113122）

黑木耳（Auricularia auricula）是中国最早开始人工栽培的食用菌，具有非常重要的食药用价值，是我国著名的“山珍”之一，享有“黑色瑰宝”、“素中之荤”之美誉。随着人们对黑木耳消费需求的提高，我国黑木耳产业发展迅猛，但是菌种科学的研究几乎处于空白。到目前为止，黑木耳栽培品种黑29、8808、黑威9、新科等多为野生种质直接驯化而来，基本上采用常规的组织分离法，杂交品种较少。因此，结合生产和市场的需求，黑木耳品种选育工作迫在眉睫[1]。选择杂交亲本是黑木耳杂交育种的关键，对黑木耳菌株进行有效的分类和亲缘关系鉴定是黑木耳育种成功与否的重要因素。基于基因组广泛存在SSR的特点，利用SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序且通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，严谨度高，稳定性和可重复性好，广泛用于食用菌系统发育、品种鉴定及遗传育种研究[2]。该文应用ISSR-PCR分子标记的方法对黑木耳菌株遗传多样性进行分析，以期为黑木耳的分类鉴定及遗传育种亲本的选配提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株（表1）。

表1 供试菌株

1.1.2 培养基。PDB综合培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，蛋白胨3 g，水1 000 mL，pH自然。用于总DNA提取的菌丝培养。

1.1.3 试剂和仪器。ISSR-PCR反应所用的 Taq DNA Polymerase、dNTP、10×buffer购自北京鼎国昌盛公司，真菌提取试剂盒（omega）、DNA marker（DL2000）、引物购自 TaKaRa有限公司（大连），PCR仪为德国Biometra公司的Thermocycler。

1.1.4 引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的的ISSR引物序列，共计20条，由TaKaRa有限公司（大连）合成（表2）。

表2 20个引物序列

1.2 方法

1.2.1 菌丝体培养。将活化的菌丝切下0.5 cm2菌块，接种于PDB综合培养基，23℃摇床培养，转数为150 r/min。将培养好的菌液用无菌水洗涤2次，用无菌滤纸吸干菌丝体表面的水分，-20℃保存备用。

1.2.2 总DNA提取及检测。采用真菌提取试剂盒提取基因组总DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量。

1.2.3 PCR反应及电泳。引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的的ISSR引物序列，由TaKaRa有限公司（大连）合成。PCR反应体系为20 μL：其中模板 DNA 1 uL（200 ng/uL），dNTPs 3 uL（2.5 mm），引物 1 μL（10 um），Taq DNA 聚合酶 0.4 uL（2.5 U/μL），10×buffer(含 Mg2+）2 μL，用 ddH2O 补至总体积 20 μL。扩增程序为：95℃预变性 5 min；95℃变性 30s；45～55℃退火 30 s（退火温度因不同引物而定）；72℃延伸105 s；4℃保存。2～4步35个循环。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，GelDoc-It型凝胶成像系统照相。

1.2.4 数据处理。电泳结果采取0/1赋值记带，将在琼脂糖凝胶上出现DNA片段的记为1，不出现的记为0，统计后输入电脑，用聚类分析软件 NTsys进行聚类分析，并计算遗传相似度。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

从20条ISSR引物中筛选出8条多态性丰富、谱带清晰且重复性好的引物，对22个供试菌株进行了ISSR-PCR扩增。8条引物共扩增出97条带（图1～4），其中多态性条带为90条，多态位点百分率为92.8%。每条引物扩增出大约12条带，DNA片段大小为250～2 000 bp。

图1 引物P1对22个黑木耳菌株的ISSR-PCR扩增效果

图2 引物P3对22个黑木耳菌株的ISSR-PCR扩增效果

图3 引物P7对22个黑木耳菌株的ISSR-PCR扩增效果

图4 引物P16对22个黑木耳菌株的ISSR-PCR扩增效果

2.2 基于ISSR分析结果构建树状图

当遗传相似系数为0.7时，供试菌株被聚类成6个类群（图5）：第1类为长城1号、菊3；第2类为野生 1、野生 2、野生 3、黑优 1、MR10、888、丰产 7、神8-7、新科 10、铁 1、春宝、海元、丰产王、889、黑威伴金；第3类为木29、黑威15；其他3类亲缘关系较远，分别为新科4、纯黑山、918，遗传相似系数达到0.8，单个菌株自成1类。

3 结论与讨论

该文应用ISSR-PCR分子标记的方法对黑木耳菌株遗传多样性进行分析，从20条引物中筛选出8条多态性丰富、谱带清晰且重复性好的引物进行了ISSR-PCR扩增，结果显示8条引物均能将供试菌株区分开，表明ISSR分子标记对黑木耳菌株遗传多样性分析是可行的。22个黑木耳菌株遗传背景比较丰富，菌株聚类结果与菌株的地理分布有关。

杂交亲本的选择是杂交育种的关键，而亲本的遗传背景及其之间的亲缘关系的确定则是选择优良亲本所必须的。由于以往亲本的选择以其地理位置、经济性状等进行收集，利用传统的菌体形态、生长特性及生理生化反应特征加以分类和比较，受环境等因素的影响较大，难以对形态差异较小的种间和种内菌株加以鉴别，给杂交亲本的选择带来很大困难。分子标记技术的迅猛发展给食用菌的品种鉴定和亲缘关系的确定带来新的活力，利用分子标记技术选择亲本可克服传统方法的缺点，它所揭示的是DNA水平遗传多样性，受环境影响小，目前利用ITS、RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SCAR 等分子标记技术进行食用菌菌株鉴定、分析种质间的遗传多样性、菌株间的亲缘关系等方面已有较多的报道。