李斯文腹水方对H22肝癌小鼠肿瘤干预机制的实验研究

李东鸽

云南省中医医院，云南 昆明 650021

癌性腹水，又称恶性腹腔积液，是指恶性肿瘤累及腹膜引起的腹水，占腹水的30%左右。癌性腹水多见于消化系统肿瘤，以肝癌和胃癌最为常见，其中肝癌约占82%，胃癌约占16%，女性多见于卵巢癌，据统计，三分之一以上的卵巢癌同时合并腹水，其它如恶性淋巴瘤、间皮瘤、子宫癌、乳腺癌也可引起癌性腹水[1]。癌性腹水发病机制是多方面的，不同肿瘤引起腹水的机制也不尽相同。腹水的出现严重影响了患者的生活质量，患者出现腹胀、腹痛、食欲下降、甚则无法进食，憋气，呼吸困难等。癌性腹水病情较之良性腹水，其量较大，生长快，病情反复，目前没有特效的治疗方法和药物，预后较差。现代医学对于癌性腹水的治疗缓解率虽然较高，但稳定性较差，且其使用的药物多为细胞毒药物或生物制剂，毒副作用较大，患者常常难以承受。而癌性腹水患者一般体质虚弱，腹腔穿刺引流腹水虽可一时缓解症状，但腹水常在短期内迅速积聚生成。患者常出现腹水明显，排尿困难，少尿或无尿，反复使用利尿剂，常产生抗药性，使常规利尿难以奏效，而且容易引起电解质紊乱。中医药在肿瘤的治疗方面，尤其是在中晚期肿瘤的姑息治疗方面，具有较好的疗效，在提高患者生活质量，延长生存期方面发挥了独特的作用。

腹水方是李斯文教授多年临床防治肿瘤的实践中，依据中医整体观念及辨证论治的特点和临床用药经验研制出的治疗肝癌的中药复方，以扶正抑癌为原则。在临床应用中发现，腹水方能够改善肝癌腹水患者的临床症状并提高生活质量。能较好地延缓了癌变及转移的进程，提高机体的免疫功能，配合放化疗，减轻放、化疗的毒副反应，从而提高了机体的耐受性。祖国医学认为，肿瘤系人体正气亏虚，邪气客聚体内所致。肿瘤在机体内的发生、生长、转移以及预后，既与人体正气的强弱有关，又与客邪之轻重及其毒性强弱有关。所以肿瘤的治疗及预后，取决于人体内部正邪双方斗争的结果。

腹水方由白术、茯苓、土茯苓、葫芦、黑丑、炒枳实、大腹皮、厚朴、甲珠等组成，具有清热解毒、健脾、软坚散结、利水通淋等作用。李斯文教授认为肿瘤患者固护脾胃后天之本极为重要，本方根据《景岳全书》茯苓汤的化裁，处方中白术、茯苓为君药，共奏通利小便，实脾的功效，土茯苓、葫芦、黑丑为臣药利湿消肿，炒枳实、大腹皮、厚朴共为佐药除痰、除胀满，甲珠为使药活血散结，肿瘤腹水患者多有痰瘀互结症状，故加甲珠。本实验通过动物实验，探讨腹水方抗肿瘤的可能机制。

1 材料

1.1 药品及试剂

实验药物：中药腹水方由云南省中医医院制剂研究中心提供，将上药加水后反复的浓煎，弃去药渣，然后再将药液混匀至浓缩为浓度为1.5 g/ml的药液，置入4℃的冰箱中保存以备用。根据中药人、鼠计量换算的标准换算后，按小鼠0.2 ml/20 g的标准给药。注射用顺铂：冻干型。按小鼠0.2 mg/ml，0.2 ml灌胃。生理盐水（0.9%NS）：按小鼠0.2 ml/20g灌胃。实验试剂：羊抗兔VEGF（19003-1-AP）、羊抗兔 HER2/ErbB2（18299-1-AP）来自proteintech；即用型快捷免疫组化试剂盒，DAB显色试剂购自，福建迈新；其他为国产分析醇。

1.2 实验动物

SPF级昆明小鼠55只，7～8周龄，体质量18～22 g，实验动物生产许可证号为：SCXK（湘）2016-0002，腹水型肝癌H22细胞株由云南省中医医院实验室提供。

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立、分组和给药

取接种8天H22腹水瘤小鼠，酒精消毒后，注射器抽取腹水，离心后，调细胞浓度为5×106个/ml，小鼠右侧腋部皮下接种0.2ml，按照随机数字表随机分为5组：荷瘤病理模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。荷瘤模型组灌胃等体积的生理盐水。

2.2 实验方法

从荷瘤次日起，中药组以腹水方0.2 mL/10 g灌胃；对照组以生理盐水0.2 mL/10 g灌胃；西药组以顺铂0.2 mg/mL，0.2 ml灌胃；以上4组，每日一次，连续给药14天。将50只健康的小鼠随机分为5个组，每组10只。分别为：空白组对照组（A组），顺铂组（B组），腹水方低剂量组（C组），腹水方中剂量组（D组），腹水方高剂量组（E组）。75%酒精消毒接种小鼠右腋部的皮肤，用0.25 ml注射器抽取0.2 ml瘤细胞悬液，然后注入B-E组小鼠的右腋部皮下接种，接种24 h后给药，随机分组：A组（0.9%NS，90 mg/Kg），B组（顺铂组0.2 mg/ml，0.2 ml），C 组（腹水方低剂量组 1.5 g/ml，0.2 ml）灌胃，D、E组（分别以3 g/ml和4.5 g/ml，0.2 ml）灌胃，各组每日用药一次，连用药14天，第15天脱臼处死小鼠。

在实验过程中，观察小鼠的饮水、进食、活动情况，对刺激的反应，毛色变化，有无腹泻、消瘦及死亡，并做好记录。比较肿瘤组织中HER-2，VEGF的结果。实验过程中，第10天，高剂量中药组死亡1只小鼠，考虑小鼠因肿瘤负荷过重死亡。

2.3 免疫组化实验方法

石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温10min后，蒸馏水洗3次。微波热复修后滴加5%山羊血清室温封闭20 min。滴加一抗，室温孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加酶标羊抗鼠、兔IgG聚合物二抗，室温孵育30 min，PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，20～37℃ 20 min，PBS洗5 min× 4次。DAB显色，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察，计算阳性率。

3 实验结果

3.1 中药对H22荷瘤小鼠瘤组织VEGF表达水平的影响

表1结果显示，与荷瘤模型组比较，阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组瘤组织VEGF表达水平显著增加，其中阳性组、低剂量组和高剂量差异有统计学意义。

表1 对H22荷瘤小鼠瘤组织VEGF表达水平的影响 （±s，n=5）

表1 对H22荷瘤小鼠瘤组织VEGF表达水平的影响 （±s，n=5）

注：与荷瘤模型比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组别荷瘤模型组阳性组高剂量组中剂量组低剂量VEGF阳性个数51±9 73±8②76±9②67±15 75±15①

图1 中药对H22荷瘤小鼠瘤组织VEGF表达水平的影响

3.2 对H22荷瘤小鼠瘤组织HER2表达水平的影响

表2免疫组化结果显示，与荷瘤模型组比较，阳性组和高剂量组瘤组织HER2表达水平低于荷瘤模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3脾指数、胸腺指数结果表示中药中剂量组脾指数和胸腺指数明显高于其他组，具有统计学意义。实验结果提示：在H22小鼠肿瘤组织中，腹水方对VEGF表达的影响，不及化疗药物顺铂，但中剂量组较高、低剂量组有明显差异，具有统计学意义。腹水方对HER2表达的影响随药物浓度的递增而增强，结果具有统计学意义。

表2 中药对H22荷瘤小鼠瘤组织HER2表达水平的影响 （±s，n=5）

表2 中药对H22荷瘤小鼠瘤组织HER2表达水平的影响 （±s，n=5）

注：与荷瘤模型比较，①P＜0.05，②P＜0.01。

组别荷瘤模型组阳性组高剂量组中剂量组低剂量HER2阳性个数69±10 49±10①54±3①62±14 72±12

图2 中药对H22荷瘤小鼠瘤组织HER2表达水平表达的影响

4 讨论

腹水方中各药物的功效及现代药理研究：

白术：苦、甘，温。归脾、胃经。健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎。用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安。白术中的芹烷二烯酮、苍术酮和白术内醋I、Ⅱ、Ⅲ均具有一定的抗炎活性[2，3]。李翠琴[4]等发现白术石油醚部位以及白术内醋I等为其抗炎有效部位和活性成分。白术能有效抑制肿瘤细胞的生长，其中的白术内酯和挥发油是抗肿瘤的活性成分。白术中的苍术酮、白术内酯I和白术内酯Ⅲ可诱导HL-60和P-388肿瘤细胞凋亡发挥细胞毒作用[5]。Huang等[6]发现白术甲醇提取物能够诱导人T淋巴瘤Jurkat细胞、U937和HI-60白血病细胞凋亡，而达到抗肿瘤的作用。Lee等[7]研究发现白术能刺激Thl型淋巴细胞增值，产生抗体，调节免疫反应。

表3 脾指数、胸腺指数

茯苓：首载于《神农本草经》，味甘、淡，性平。归心、肺、脾、肾经。利水渗湿，健脾和胃，宁心安神的功效。茯苓中的主要成分茯苓多糖既可增强细胞免疫，又可增强体液免疫，是很好的免疫增强剂。茯苓多糖的免疫抑癌作用是多靶点的，几乎遍及非特异性免疫和特异性免疫应答的多个环节[8]。谈新堤[9]实验显示，茯苓多糖治疗组的小鼠脾脏脾小体数量增多明显，脾中央动漫周围淋巴鞘增宽，淋巴细胞密集，表现出茯苓多糖对脾脏的保护作用。茯苓多糖[10]能增强细胞免疫，调整T细胞亚群比值，同时激活B淋巴细胞，增强其活性，尤其是细胞毒性T淋巴细胞活性。茯苓多糖通过增强肿瘤坏死因子（TNF）基因的转录而增强巨噬细胞释放TNF，并增强其活性，增强NK细胞活化，促使其分泌白细胞解读IL-2、TNF-2等形成杀伤肿瘤细胞的免疫系统。能增强基因Fas、Bax的表达，增强其对自身或免疫细胞FasL的凋亡敏感性，下调肿瘤细胞FasL的表达而降低其对Fas/Fasl系统的反击能力，防止肿瘤细胞发生免疫逃逸[11，12]。茯苓在《金匮要略》中的配伍运用规律：常用剂量为四两和三两，主要发挥利湿和健脾宁心得作用。茯苓-白术：主治口渴、小便不利、目眩、心下胀满者[13]。茯苓多糖能增强基因Fas、Bax的表达，增加其对自身或免疫细胞Fasl的凋亡敏感性，并下调肿瘤细胞FasL的表达而降低其对Fas/Fasl系统的反击能力，防止肿瘤细胞发生免疫逃逸[14，15]。

土茯苓：性味：甘淡，平。归肝经、胃经、脾经。功能：解毒，除湿，利关节。主治：治梅毒，淋浊，筋骨挛痛，脚气，疗疔疮，痈肿，瘰疬，梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛。白丽等[16]以左旋咪唑为阳性对照组，观察赤土茯苓苷对小鼠的胸腺指数、脾脏指数、血清溶血素、溶血空斑形成细胞数、腹腔吞噬细胞吞噬中性红和超敏反应的影响。发现赤土茯苓苷可使小鼠的胸腺、脾脏指数增加，其中剂量为30 mg/kg时作用最显著（P＜0.001），赤土茯苓苷的各剂量组均使小鼠血清溶血素和溶血空斑形成细胞数明显增加（P＜0.001），能增加小鼠腹腔吞噬细胞吞噬中性红的能力。吴丽明等[17]观察到土茯苓的提取物落新妇苷可使大鼠的尿量增加而且该作用呈剂量-反应关系，同时通过小鼠扭体反应试验和热板法镇痛试验表明，落新妇苷能显著提高小鼠的热板痛阈值，表明落新妇苷有明显镇痛作用。张白嘉等也[18]研究土茯苓中的落新妇甙能明显增加大鼠尿量。杨晓鲲等[19]发现土茯苓提取物可通过诱导Eca-109和SGC-7901细胞凋亡和阻滞细胞周期抑制其增殖，最终发挥抗肿瘤作用，其对COLO206结肠癌细胞也有一定的抑制作用。

葫芦：甘，平。利尿，消肿，散结。用于水肿，腹水，颈淋巴结结核。Wakimoto等[20]用乳腺癌动物模型研究发现，腹腔注射给予葫芦素B6周后，肿瘤体积较对照组缩小55%，器官和组织并未见明显损伤。Thoennissen等[21]研究表明，葫芦素B可明显抑制胰腺癌生长。Sun等[22]报道，葫芦素B对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制率为53.6%。

黑丑：性寒，味苦归肺、肾、大肠经；有小毒；泻水，驱虫。张虹等[23]发现黑丑可以有效的稳定G-四链体结构，进而可以通过抑制端粒酶的活性的途径，破坏肿瘤细胞的永生化，最终导致肿瘤细胞凋亡。

枳实：最早记载于《神农本草经》苦；辛；寒。归脾；胃；肝；归心经。积滞内停；痞满胀痛；大便秘结；泻痢后重；结胸；胃下垂；子宫脱垂；脱肛。有研究表明，柑桔黄酮可诱导白细胞抑制HL260白血病细胞的生长[24]。Sergeev I等[25]研究表明多甲氧基黄酮能够诱导Ca2+介导的乳腺肿瘤细胞的凋亡，Manthey J A等[26，27]表明陈皮中的多甲氧基黄酮对人体肺、结肠、乳腺ER+、乳腺ER-、前列腺、黑素瘤6种癌细胞群有很强的抗增殖活性。

厚朴：味苦辛，性温，归脾经、胃经、大肠经。行气消积；燥湿除满；降逆平喘。“医圣”张仲景，在其所著《金匮玉函方》的210个古方中，有厚朴配伍的处方多达25个，占了11.9%，可见厚朴在我国传统中药的重要地位。现代研厚朴中的主要成分究厚朴酚与和厚朴酚在体内和体外均被发现可以抑制新生血管及肿瘤生长，并且在有效剂量范围内能够被宿主很好的耐受，其作用机制是在人的内皮细胞通过干扰血管内皮生长因子受体 2（VEGFR2）的磷酸化来抑制血管生成[28，29]。邓俊芳研究发现和厚朴酚作为厚朴的主要有效成分之一，在体外能以剂量和时间依赖方式明显地抑制PANC-1细胞生长，细胞凋亡和细胞G1期阻滞是其主要机制。

甲珠：味咸，性凉，入肝胃经。具有消肿溃痈，搜风活络，通经下乳的功效。穿山甲的鳞片主要成分是蛋白质，含硬脂酸，胆甾醇，N-丁基-二十三（碳）酰胺，环L-丝氨酰-L酪氨酰）二肽[cyclo（L-seryl-L-trosyl）]和环（D-丝氨酰-L-酪氨酰）-L-酪氨酰二肽[cyclo（D-seryl-L—tyrosyl），又含锌、钠、钛、钙等18种元素。水溶液含多种游离氨基酸，还含挥发油和水溶性生物碱（穿山甲碱）等。穿山甲具有降低血液粘度，抗炎，提高小白鼠常压缺氧的耐受能力，穿山甲碱能升高白细胞，增强机体的免疫[30]。王英[31]研究穿山甲蛋白提取物在体外抑制K562细胞的影响中发现，穿山甲蛋白提取物在体外可抑制K562细胞增殖并诱导凋亡的抗白血病细胞效应。

中医药对肿瘤的治疗作用越来越受到重视，中药腹水方对H22小鼠肿瘤组织有一定的抑制作用，可能通过调节VEGF的蛋白表达，来抑制肿瘤血管的生成，中剂量组与低剂量组比较差异有统计学意义，且高剂量组可明显降低肿瘤组织内HER-2的表达，今后应进一步深入研究腹水方对肿瘤抑制的机制。