扶正抗癌方通过DNMT1-p21通路对A549细胞增殖的影响

赵越洋，周宇姝，吴万垠

1.广东省中医院血液科，广东 广州 510370；2.广东省中医院肿瘤科，广东 广州 510370

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

肺腺癌细胞株A549购买自中国科学院上海生命科学研究院，其无EGFR基因突变，对EGFRTKI低敏感的细胞株。

1.1.2 药物

扶正抗癌方药材购于广东省中医院药房，组成：太子参15 g、白术15 g、黄芪30 g、炒薏苡仁30 g、甘草10 g、山慈菇30 g、蛇舌草30 g、龙葵30 g、石见穿30 g、八月札30 g、蛇泡簕30 g、莪术15 g。取出药材，加入2L纯水并浸泡30分钟，共煎煮2个小时，煎煮过程中避免药物水蒸气溢出瓶口，煎好后将水煎液移至烧杯中，混匀前后两次药液。

使用冷凝回旋浓缩仪浓缩药液，收集浓缩液。将中药浓缩液转移至100 mm×100 mm的细胞培养皿中，将盖子取掉用保鲜膜封好，放于-80℃冰箱过夜。在扶正抗癌方进行干燥之前将保鲜膜上面留有小孔以排气，培养皿放置于真空干燥仪过夜进行干燥，参数设置如下：先预热20分钟，主干燥24小时；终末干燥2小时；干燥压力为0.165 mbar；温度为4℃。干燥完成后收集中药冻干粉并称量全部冻干粉重量，将冻干粉放在干燥管内进行密闭保存。

1.1.3 主要试剂

RPMI-1640基础培养基、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（1X）培养基、胰酶、噻唑蓝（MTT）、Trypan Blue试剂、二甲基亚砜（DMSO）、吐温20（Tween 20）、异氟烷、3×loading buffer、p21Waf1/Cip1（12D1）RabbitmAb、DNMT1（D63A6）XPRabbitmAb（CST公司）；化学发光液。

1.1.4 主要仪器

自动细胞计数板、自动细胞计数仪（美国Count Star公司）；涡旋振荡器；脱色摇床；酶标振荡器（IKA公司）；离心机（5418）；高速冷冻离心机（5702）；细胞培养箱（德国Eppendorf公司）；酶标仪（TECAN Infinite F500）；化学发光成像系统、半干转膜仪（BIO－RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

培养条件为37℃，5%二氧化碳环境，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养细胞。当10 cm×10 cm培养皿细胞长至80%左右融合后可以传代，弃原培养基，加入干净的4℃PBS冲洗2～3次，每个培养皿中加入胰酶1 mL，后将培养皿放置于培养箱消化1 min，待细胞皱缩变圆，但尚未完全脱落时移除胰酶，加入3 mL完全RPMI-1640培养基终止消化，轻轻吹打细胞，按1∶3～1∶5比例传代继续培养。

1.2.2 药物配制

开始实验前，取扶正抗癌方冻干粉0.5 g加入无血清RPMI-1640培养基中，涡旋并充分混匀，直到扶正抗癌方颗粒完全溶解，使用10mL注射器吸取溶液，用0.22μm滤器过滤，置于50mL离心管4℃保存，药液尽量在1周内使用。

1.2.3 MTT活力检测

将A549用胰酶消化，用计数仪计数后以每孔5×103细胞数接种于96孔板中，将96孔板放置于培养箱过夜，24 h后分别给予每个孔以不同剂量的扶正抗癌方（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L），每孔加入含扶正抗癌方的培养液100 μL，均设置3～5个复孔，在24、48、72 h时3个时间点进行测量MTT值，用排枪吸取培养基，后可用PBS清洗一次，然后于每孔加入MTT溶液100 μL，MTT溶液是使用MTT粉配置而成，将96孔板放置于培养箱孵育3～4 h，弃MTT溶液，后于每孔加入100 μL DMSO（非细胞实验用），在振荡仪上充分混匀8-10分钟，使用酶标仪以490或者570 nm波长检测其每孔的吸光值，记录每孔检测数值。其中24 h、48 h、72 h 3个时间点各需要重复3次实验。每一浓度不同组取5～8个复孔的平均值，将对照组细胞存活率设为100%，各个扶正抗癌方加药组细胞存活率计算公式如下：复孔存活率=1-（扶正抗癌方组OD值/对照组OD值）×100%。沉默p21基因表达后扶正抗癌方对A549细胞增殖的影响实验：设置对照组、FZKA组（2.0 mg/L）、p21 siRNA组和FZKA（2.0 mg/L）+p21 siRNA组，余实验步骤同上。本研究中对照组中仅加入1640培养基，不含其他操作。

1.2.4 蛋白质印迹法

将A549用胰酶消化后接种至6孔板，贴壁后加入不同浓度的扶正抗癌方或者其他方式处理，弃原培养基，PBS清洗后，加入30-50 μL细胞裂解液，用细胞刮棒刮下细胞，在4℃，15 000 rpm离心机离心15 min。按5×loading按比例（loading：上清液＝1∶4）加入上清液，混匀之后，放置于水浴恒温器中100℃变性5 min，于-80℃保存。将电泳槽、电泳缓冲液、样品准备好，接好电泳槽的正负极，将SDS-PAGE凝胶固定于电泳槽中，将蛋白样品按计算好量左-右顺序等量加入每个梳孔。浓缩胶以恒压80 V电泳0.5 h，分离胶以恒压120 V电泳1.5 h；电泳完毕后取出凝胶，按从下到上“滤纸－PVDF膜－凝胶－滤纸”顺序置于半干转电泳仪中，恒压20 V转膜70 min。转膜完成后，将PVDF膜置于脱脂牛奶中，孵育1 h。一抗抗体床孵育4 h以上，或者4℃过夜。用1×TBST于室温摇床洗膜3次，每次5～10 min。二抗孵育1h后回收，1×TBST洗膜3次，每次5～10 min。将蛋白条带放置盒子中，随后在Image Lab软件进行数据处理。

1.3 统计学方法

实验数据大多为定量数据，以Means±SD表示。数据使用Graphpad Prism 5.0软件录入，后进行正态性及方差齐性检验，如果满足正态性及方差齐性时，多组间比较可采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间比较则采用t检验；若不满足正态性或者方差齐性，采用非参数检验。按检验水准α=0.05，即差异具有统计学意义标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 扶正抗癌方对A549细胞增殖的影响

随着扶正抗癌方浓度的增加和时间的延长，A549细胞活力逐渐降低，从24、48 h的1.0 g/L浓度和72 h的0.5 g/L浓度加药组开始，与对照组比较，细胞活力受到抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05）；A549细胞在24 h、48 h、72 h的半数抑制浓度IC50（Half Maximal Inhibitory Concentration）分别是分别为2.53、1.92、1.36 g/L。见表1。

表1 不同浓度扶正抗癌方不同时间对A549细胞活力的影响

2.2 扶正抗癌方对DNMT1和p21蛋白表达的影响

本研究将A549细胞用胰酶消化后以每孔4.0×105细胞数接种至6孔板，待细胞贴壁后，处理组分别给予0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL剂量的扶正抗癌方处理两组细胞，作用24h后，再利用WB检测DNMT1和p21蛋白的表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为对照，此试验均重复3次或以上，结果如下图。图1、图2分别为扶正抗癌方对DNMT1、p21蛋白表达的影响。

该实验结果显示，随着扶正抗癌方的浓度的增加，该细胞株DNMT1T蛋白的表达量依次下降，p21蛋白表达量依次上升。当扶正抗癌方浓度为1 mg/mL至2.5 mg/mL时与未加药组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。统计数据见表2。

2.3 沉默p21后扶正抗癌方对A549细胞增殖的影响

图1 扶正抗癌方对DNMT1蛋白表达的影响

胰酶消化细胞后接种至96孔板，24h贴壁后，将外源性p21siRNA加入细胞株，后通过MTT法观察扶正抗癌方对肺癌细胞生长的影响，结果显示扶正抗癌方抑制A549细胞的细胞活力，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；FZKA联合p21siRNA组与扶正抗癌方组对比，差异具有统计学意义，提示沉默p21逆转了扶正抗癌方对细胞增殖的抑制效应，见表3。0

图2 扶正抗癌方对p21蛋白表达的影响

表2 扶正抗癌方对肺癌A549细胞DNMT1、p21蛋白表达的影响

表3 扶正抗癌方A549细胞增殖的影响

3 讨论

本研究进行体内和体外实验，探索扶正抗癌方抑制人肺癌细胞生长的潜在机制，实验结果显示扶正抗癌方通过降低DNMT1蛋白的表达，进一步促进p21基因的表达，进而抑制肺癌细胞的增殖。

DNA甲基化是真核生物细胞DNA最普遍常见的修饰，是一种重要的表观遗传学标记，能影响染色质的结构与基因的表达。DNA甲基转移酶主要起到催化DNA甲基化的作用。许多研究发现，DNMT1低表达的肿瘤患者，对肿瘤治疗有较好的效果和较高的生存率。而DNMT1或DNMT3a高表达的肿瘤患者，对化疗药的敏感性较差。其中低甲基化或去甲基化可以抑制生物癌基因的表达，可以促进抑癌基因的表达，进一步抑制肿瘤细胞的生长。DNMT1有可能成为治疗肿瘤的潜在靶点[5]。本文研究发现扶正抗癌方可以以浓度依赖性下调DNMT1蛋白表达。

在肺癌的形成过程中，p21是作为抑癌因子。Shoji T研究发现p21蛋白的缺失与肺癌的预后不良相关[6]。在老鼠动物模型实验中，有研究发现对于p21蛋白表达量高的老鼠比p21蛋白表达量低老鼠更易患肺部肿瘤[7]。另外，Wu等[8]研究发现早期p21蛋白低表达的患者比p21蛋白高表达的患者肿瘤无复发生存率低。Tan等发现p21（WAF1）在哺乳动物细胞中负调控DNMT1表达，它可能在哺乳动物细胞分裂中发挥关键作用，以确保调控的DNMT1表达和DNA甲基化[9]。Xu等在研究中提出在前列腺癌PaTu8988细胞中，沉默DNMT1，p21的表达上调以及Bax/Bcl-2的表达升高[10]。

本研究探讨DNMT1/p21通路在扶正抗癌方抑制肺癌细胞生长过程中的作用，利用细胞沉默p21表达后，采用MTT法检测对细胞活力的影响。结果显示扶正抗癌方联合p21siRNA组较扶正抗癌方组的细胞活力增强，表明沉默p21逆转了扶正抗癌方对细胞增殖的抑制，从而也证实p21参与扶正抗癌方对肺癌A549细胞生长的调节。

综上可知，扶正抗癌方可通过DNMT1-p21通路抑制DNMT1蛋白表达，进而促进p21表达，进一步抑制A549细胞的增殖。