铁氰化钾法测定药用麦芽糊精中还原糖含量

陈 皓 ，周 冰 ，黄桂琴

（1.重庆医药工业研究院有限责任公司，重庆 400065； 2.重庆大学化学化工学院，重庆 401331）

在食品行业中，麦芽糊精可用作糖果、果汁、糕点中的功能性原料和调节剂[1]。其溶液能在胃肠道快速释放葡萄糖的同时又不含果糖、半乳糖、乳糖和蔗糖等，特别适用于那些消化道糖不耐受疾病患者[2]。在制药工业中，麦芽糊精可用作药物辅料，如口服固体制剂的填充剂、液体制剂增稠剂和药物助分散剂等，可将其作为片剂的直压型辅料[3]、口腔膜剂的填充剂[4]和挤压成型速释片的基质材料[5]等，近年来也广泛应用于纳米药物包封、3D打印药物[6]等一些新兴制药领域。从马铃薯、玉米、大米等农作物中提取出淀粉，经适当工艺水解可制得麦芽糊精，其主要成分是系列链长分布范围较宽的糖类化合物，包括多聚糖、低聚糖、寡糖等[7]。还原糖含量也称为葡萄糖当量（DE），可作为划分不同规格产品的依据。《美国药典》（United States Pharmacopoeia）收载有麦芽糊精标准[8]，采用斐林试剂法检测还原糖含量。该方法操作和计算不复杂，但影响试验结果的因素较多，如还原糖实际含量、溶液浓度、加热效率、共沸时间、滴定速度、终点观察等[9]。本研究中建立了利用铁氰化钾等试剂与麦芽糊精中的还原糖反应后，用分光光度计进行检测，为药用麦芽糊精的还原糖含量检测提供了新思路。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XS105Du型电子天平（梅特勒-托利多国际贸易＜上海＞有限公司）；Agilent Cary 8454型紫外可见分光光度计（安捷伦科技有限公司）；HH-S26S型数显恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。

1.2 试药

铁氰化钾（成都市科隆化学品有限公司，批号为2017110801）；六水合三氯化铁（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20180110）；无水草酸（成都化夏化学试剂有限公司，批号为2017011702）；碳酸钠（天津市光复科技发展有限公司，批号为20160218）；D-无水葡萄糖（美国Sigma-Aldrich公司，批号为SLBP5997V）；五水硫酸铜（广东光华科技股份有限公司，批号为20171024）；酒石酸钾钠（成都市科隆化学品有限公司，批号为2018040201）；氢氧化钠（重庆川东化工集团有限公司，批号为20180301）；次甲基蓝（三水，上海三爱思试剂有限公司，批号为20180202）；药用麦芽糊精（山东西王集团有限公司，批号为1805013）。

2 方法与结果

2.1 美国药典方法

根据《美国药典》（USP41）方法，取葡萄糖制备成质量浓度为10 g／L的对照品溶液。取麦芽糊精5 g，制得质量浓度为50 g／L的供试品溶液。

取碱性酒石酸铜试液25 mL，置锥形瓶中，平行取2份。其中1份在2 min内加热至沸腾，并用对照品溶液滴定到近终点（比预期终点少0.5 mL），保持微沸，加亚甲蓝溶液（1%，g／mL）2滴，在1 min内用对照品溶液完成滴定（蓝色消失）；再将另1份加热至沸，用供试品溶液作滴定液，同法滴定，计算得还原糖含量为5.80%（以葡萄糖计）。试验过程中发现，多个方法参数，如加热温度、沸腾状态、指示剂加入时机等均不易精确控制，且还直接影响试验结果。

择期，更换试验员，同法测定同一批供试品，计算得还原糖含量为6.62%（以葡萄糖计）。2次结果相对极差为13.2%。斐林试剂法可能存在结果不易重现的问题。

在制药行业中，分析方法在其整个生命周期里往往面临在多个实验室间转移的需求，因此需要方法的影响因素易控，结果易重现。当需要测定药用麦芽糊精时，斐林试剂法不作首选。

2.2 铁氰化钾法

2.2.1 原理

铁氰化钾法又称为Park-Johnsonferricyanide submicromethod[10]。铁氰化钾是一种具有氧化性的络合物，在一定条件下，麦芽糊精中还原糖与铁氰化钾发生氧化还原反应，生成无色的亚铁氰化钾，亚铁氰化钾可继续与三氯化铁发生显色反应，定量生成普鲁士蓝，此化合物在草酸溶液中具有一定的稳定性[11]，有明显的可见光吸收。化学反应式步骤如下。

2.2.2 溶液制备

标准曲线溶液：精密量取葡萄糖贮备液（质量浓度为 1 g ／L）0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分别置 100 mL 容量瓶中，加水定容。精密量取各5 mL，分别置5支试管中，均加入碳酸钠溶液2 mL和铁氰化钾试液2 mL，置70℃水浴中加热30min，取出，迅速用流水冷却至室温，用草酸溶液将pH调至3.6，加入三氯化铁溶液5 mL，静置5 min使显蓝色，再分别移至50 mL容量瓶中，用水定容。

供试品溶液：称取样品粉末60 mg，置100 mL容量瓶中，加水定容，精密量取2.0 mL，置试管中，精密加水3 mL、碳酸钠溶液2 mL和铁氰化钾试液2 mL，置70℃水浴中加热30min，取出，迅速用流水冷却至室温，用草酸溶液将pH调至3.6，加入三氯化铁溶液5 mL，静置5 min使显蓝色，再分别移至50 mL容量瓶中，加水定容。

2.2.3 测定波长选择

取葡萄糖贮备液，用水稀释成20 μg／mL，精密量取5 mL，置试管中，按标准曲线溶液项下方法显色后，在600～800 nm波长范围内扫描。结果在700～720nm波长范围内吸收波段较强，最终选择710 nm作为测定波长。

图1 紫外吸收光谱图

2.2.4 铁氰化钾用量选择

取葡萄糖贮备液，用水稀释成2 μg／mL，精密量取5 mL，置试管中，平行5份，各加碳酸钠溶液2 mL、铁氰化钾试液0.5～2.5 mL，按标准曲线溶液项下方法显色后，在 710 nm 波长处显色。铁氰化钾用量为 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 时，吸光度分别为 0.592 4，0.632 5，0.635 0，0.643 4，0.641 5。结果表明，铁氰化钾试液的加入量在1.0～2.5 mL范围内，吸光度稳定。

2.2.5 温度、时间考察

铁氰化钾与还原糖的反应需要碱性环境和较高的温度条件，加热时间对结果也有明显影响。经多次试验，当水浴温度为65～100℃、水浴时间不低于25 min时，测定结果稳定。

2.3 样品含量测定

取麦芽糊精样品，按铁氰化钾法供试品溶液项下方法显色后，于710 nm波长处测定吸光度，按照标准曲线法计算其中的还原糖含量。平行测定6份，还原糖以葡萄糖计。详见表1。

表1 样品含量测定结果（n＝6）

2.4 铁氰化钾法验证

重复性试验：由不同试验人员，在不同日期，按铁氰化钾法分别测定还原糖含量，结果分别为6.13%和6.04%，考察2 d结果的相对极差为1.50%。

线性关系考察：以显色反应的相应试剂为空白溶液。取已显色的标准曲线溶液，于710nm波长处测定吸光度，以标准曲线溶液中葡萄糖的质量浓度（C，μg／mL）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A＝0.286C＋0.032 3，r＝0.999 7（n＝5）。结果表明，葡萄糖质量浓度在 0.50 ～ 4.00 μg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。

定量限确定：取空白溶液，于710 nm波长处测定20次吸光度，并统计标准偏差（σ），再结合回归方程的斜率（S）计算。定量限 ＝（10× σ）／S＝（10×0.003 7）／0.286 ＝ 0.13 μg ／mL。

准确度试验：取已知还原糖含量（以葡萄糖计）为6.1%的麦芽糊精样品约60 mg，用水溶解后取溶液适量（相当于麦芽糊精 1.2 mg，还原糖 73.2 μg），平行 9份，按已知还原糖含量的80%，100%，120%加入葡萄糖对照品，每个比例3份，稀释至线性范围内，依法测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 准确度试验结果（n＝9）

3 讨论

还原糖含量是麦芽糊精等多糖类化合物的关键质量指标。前人总结了常见的还原糖测定方法，大致可分为碱性酒石酸铜（斐林试剂）法、碱性铜溶液法、碱性汞溶液法、碱性铁氰化物法、低碘酸盐法、亚硒酸法等[12]。美国药典采用斐林试剂法测定麦芽糊精还原糖，但存在一些不足，有改进必要。

本研究中建立了一种基于碱性铁氰化物还原的分光光度法测定麦芽糊精的还原糖含量，其线性范围为0.50～4.00μg／mL，相关系数大于0.999，RSD小于5%，回收率为89.69% ～100.21% 。不同人员的测定结果较斐林试剂法易于重现。本方法中，在0.18～1.18 AU范围内，还原糖浓度与有色产物吸光度线性关系良好。但麦芽糊精有多种规格，其还原糖含量分布范围较宽，还原糖含量为5%～20%。为了避免高含量规格糊精制备的供试品溶液浓度超出线性范围，可参考美国药典的方法，先进行1次预试验，估算待测糊精的还原糖大致浓度范围，再设计合理的稀释倍数，使溶液终浓度落在本方法的线性范围内，以便获得满意的测定结果。

文献[13]报道，普鲁士蓝由亚铁氰化钾和氯化铁反应制得，不同比例的反应物所得的产品不同。当反应物之比为1∶1时，产物是亚铁氰化铁钾，为可溶性普鲁士蓝；当反应物之比为3∶4时，产物是亚铁氰化铁，为不溶性普鲁士蓝。氯化铁用量远大于第1步反应中产生的亚铁氰化钾的量，推测终产物中有亚铁氰化铁出现。为此，加入草酸提高了不溶性普鲁士蓝的可溶性。

新建的铁氰化钾法测定麦芽糊精还原糖的灵敏度好，操作简便，参数易控，结果稳定。在麦芽糊精及其他多糖化合物的还原糖含量测定中具有广阔的应用前景。