RIPK4、β-catenin和P-gp在骨肉瘤中的表达及临床意义

梁爽

骨肉瘤为骨关节常见恶性肿瘤，近年来随着临床研究的不断深入，人们发现蛋白激酶(RIPK4)、β-连环蛋白(β-catenin) 和P-糖蛋白(P-gp)等表达与疾病的发生、进展、是否转移等方面有密切关联[1-2]，为进一步明确上述基因在骨肉瘤中的表达及意义，笔者选取我院收治的60例患者进行研究分析及长期随访，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取自2012年3月至2014年1月在我院接受手术治疗的40例骨肉瘤患者作为研究对象，均经病理活检证实。其中男25例，女15例；年龄7～65岁，平均年龄(40.29±3.33)岁；Enneking分期[3]：Ⅰ/ⅡA期为17例，ⅡB/Ⅲ期23例；其中成纤维细胞型6例，成软骨细胞型10例，成骨细胞型21例，混合型3例；其中发生肺转移患者15例。

1.2 试剂与方法

1.2.1 使用试剂 RIPK4 羊多克隆抗体由美国Abcam公司提供，兔抗人β-catenin多克隆抗体由英国Abcam公司提供，鼠抗人P-gp单克隆抗体由北京中山生物技术公司提供，S-P免疫组化试剂盒由福州迈新生物技术开发公司提供。

1.2.2 方法 取骨肉瘤组织标本，常规石蜡包埋组织标本，切片、脱蜡，免疫组化染色严格按照试剂盒说明书进行：水化切片后，在RIPK4和β-catenin检测时，首先采用pH 6.0柠檬酸钠0.01 mol/L进行抗原修复，在对P-gp进行检测时首先采用pH 8.0的EDTA 0.5 mol/L进行微波抗原修复，加入3%过氧化氢溶液内孵育10 min，加入稀释过的山羊抗人RIPK4多克隆抗体(1∶200)、兔抗人β-catenin多克隆抗体(1∶200)及鼠抗人P-gp单克隆抗体(1∶40)，4 ℃室温下放置一夜；室温放置10 min后，以0.01 M PBS洗涤3次；加入二抗，于37 ℃温度下放置10 min，0.01 M PBS再次洗涤3次。DBA显色，苏木素对比染色，脱水透明并进行封固。PBS作为阴性对照。

1.3 判定标准 RIPK4、β-catenin阳性[4]：细胞膜和(或)细胞质内有棕黄色颗粒。每张切片中随机取10个高倍视野，取100个细胞，依照阳性细胞占据比例以及染色强度制定评价标准。β-catenin阳性结果判定[5]：从细胞质、细胞膜以及细胞核等方面对细胞内β-catenin分布情况进行判断，细胞膜表达缺失或减弱、异位表达均为阳性表达。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件分析数据，计数资料采用率表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Enneking 不同分期及肺转移者RIPK4、β-catenin、P-gp阳性表达比较(表1) ⅡB/Ⅲ组骨肉瘤组织内RIPK4、β-catenin、P-gp阳性表达率明显高于Ⅰ/ⅡA组，差异有统计学意义(P＜0.05)。合并肺转移骨肉瘤组织的RIPK4、β-catenin、P-gp阳性表达均明显高于无肺转移者，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 不同病理分型与RIPK4、β-catenin、P-gp 阳性表达比较(表2) 不同病理分型骨肉瘤组织的RIPK4、β-catenin 和 P-gp阳性表达比较差异无统计学意义，二者无相关性(P＞0.05)。

表1 Enneking不同分期及肺转移者RIPK4、β-catenin、P-gp阳性表达比较[n(%)]

表2 不同病理分型与RIPK4、β-catenin、P-gp阳性表达比较[n(%)]

2.3 生存时间与RIPK4、β-catenin和P-gp阳性表达 RIPK4、β-catenin和P-gp阳性表达组患者平均生存时间为(3.19±0.68)年，RIPK4、β-catenin和P-gp阴性表达组患者平均生存时间为(4.70±0.56)年，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 骨肉瘤患者生存时间相关影响因素多因素分析(表3) 多因素回归分析显示，Enneking分期、RIPK4及P-gp阳性表达与患者生存时间具有正相关性(P＜0.05)。

表3 骨肉瘤患者生存时间相关影响因素多因素分析

3 讨论

近年来，随着临床对骨肉瘤研究的不断深入，特异性标志物在疾病的诊断、病情监测中的价值逐渐被发现。COX-2、MMP-9等为临床用于肿瘤的诊断指标，然而其特异性及敏感性均较低，难以满足临床诊断的要求[6]，因此需找新的标志物并通过联合检测来提高诊断特异性已经成为临床共识。RIPK4属于苏/丝氨酸蛋白激酶家族，在皮肤癌、卵巢癌及肝癌等多种恶性肿瘤中有强阳性表达，且在肿瘤的发生、侵袭以及转移中有所参与。本次研究结果显示，骨肉瘤组织内可见RIPK4强表达，且ⅡB/Ⅲ期、合并肺转移者RIPK4阳性表达率明显更高。黄炎等[7]在研究中发现，肿瘤的发生、发展为多基因共同参与的复杂过程，其中β-catenin有着重要参与，主要通过结合型、游离型两种方式存在，当Wnt细胞通路激活后，细胞质β-catenin降解受到抑制，大量积聚在细胞质内，并经细胞核与T细胞因子/淋巴增强因子相结合，启动MDR基因与靶基因C-myc等转录，诱导肿瘤的发生。β-catenin与肿瘤分期、是否合并肺转移等具有密切相关性，且其可以预测预后，提示β-catenin在骨肉瘤的发生与发展中可能有所参与。P-gp 为ABC转运蛋白家族的主要成员，为MDR1基因编码的跨膜糖蛋白，有研究发现骨肉瘤患者化疗效果不佳与其作用机制有着密切关系[8-9]，P-gp可水解产生能量，并将抗肿瘤药物主动泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞内药物浓度大大降低，引起耐药现象的出现。本次研究中，P-gp阳性表达高，且与Enneking分期以及肺部转移有关，白璐等[10]研究发现，随着肿瘤分期的增高，P-gp的阳性表达率呈现出正相关表现。

本次研究对患者进行5年的随访，RIPK4、β-catenin和P-gp阴性表达组患者的生存时间明显长于阳性表达组患者(P＜0.05)，随着RIPK4、β-catenin和P-gp表达的增强，则肿瘤体积增加且随着血液转移至肺部，导致患者死亡，因此有学者主张对上述特异性因子进行抑制，从而改善预后[11-13]。动物实验显示[14-15]将RIPK4 shRNA转染入大鼠体内，从而对PIPK4基因的表达进行抑制，结果发现随着时间延长，大鼠体内肿瘤体积呈现出缩小趋势，由此可见通过对特异性因子表达进行抑制，能够为骨肉瘤预后的逆转提供新的治疗靶点。

综上所述，RIPK4、β-catenin和P-gp基因与肿瘤的发生、侵袭以及转移之间有着密切关系，能够预测结局，为临床治疗提供新的思路。