携带抗FAP×抗CD3双特异性抗体重组溶瘤痘病毒的构建及其抗癌活性观察

施晋升，李峰，吴思慧，俞力超，刘黎琼，于峰

（1.江苏大学附属医院心胸外科，江苏镇江212001；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013；3.深圳市南山区人民医院血液科，广东深圳5180052；4.江苏大学生命科学研究院，江苏镇江212013；5.上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室，上海200032）

肺癌的常规放化疗方案毒副反应明显且敏感度不高，靶向免疫治疗逐渐成为肺癌治疗策略之一。肿瘤微环境对肿瘤发生、进展以及治疗具有重要作用［1］。成纤维细胞是肿瘤微环境中重要的基质细胞，成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）表达于 90%以上的基质成纤维细胞［2］。单纯靶向肿瘤细胞治疗的效果不甚理想，而靶向FAP阳性的肿瘤基质细胞能增强抗肿瘤效果［3］。

溶瘤病毒是一类经过基因改造后能选择性在肿瘤细胞内复制增殖，裂解肿瘤细胞后子代又能扩散到临近肿瘤细胞的病毒。该类病毒因特异性强、副反应小而成为肿瘤靶向治疗的新型工具［4］。目前已经有10余种溶瘤病毒用于临床试验，例如腺病毒、疱疹病毒和牛痘病毒（vaccinia virus，VV）等。牛痘病毒因其良好的安全性而被广泛应用于临床，例如作为疫苗消灭天花。此外，由于牛痘病毒具有溶瘤速度快、外源基因承载能力大（约25 kb）、溶瘤同时激发机体抗肿瘤免疫应答等优点成为溶瘤病毒的典型代表［5］。虽然临床研究显示，溶瘤痘病毒及其激活的免疫反应能在肿瘤组织被检测到，但其抗肿瘤效果仍不理想［6］。为了增强抗肿瘤效果，我们构建了携带抗FAP和抗小鼠CD3分子双特异性分子（BiTE.FAP）的重组溶瘤痘病毒（recombinant oncolytic double deleted vaccinia virus-Bispecific T cell Engager-FAP，rVVDD-BiTE.FAP），并在体外检测其对过表达FAP蛋白小鼠肺癌细胞的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

痘苗生长因子（vaccinia growth factor，VGF）基因缺失的亲本病毒vSC20、rVVDD-GFP病毒、pCDHFAP-GFP慢病毒质粒、pSEL2N1质粒、非洲绿猴肾CV-1细胞株、人骨肉瘤HuTK-143B细胞株由本实验室保存；小鼠肺癌LLC细胞株和小鼠肺癌LL/2细胞株购于南京凯基生物公司；LLC-GFP和LLCFAP细胞株是本课题组采用慢病毒转导构建而成的稳定细胞株；8～12周SPF级C57BL/6小鼠，雌雄不限，体重20～22 g，由江苏大学实验动物中心提供（合格证号：201607173）；胎牛血清（美国 Gibco公司）；RPMI1640、DMEM培养基（上海 HyClone公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；BudR（美国Sigma公司）；限制性内切酶NotI和EcoR V（美国NEB公司）；PCR扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；MTS试剂盒（北京Promega有限公司）；基因组抽提试剂盒及LDH试剂盒购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；IL-2和IFN-γ浓度检测用ELISA试剂盒（美国BD公司）。

1.2 pSEL2N1-BiTE-FAP重组质粒的构建

以pSEL2N1空载质粒为模板扩增PSEL-DsRed基因。所用的引物序列：PSEL-DsRed，上游5′-AATTCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAATGGCCTCCTCCGAGAAC-3′，下游5′-GGTATCTTGCGGGATATCCTACAGGAACAGGTGGTG-3′。以pCDH-FAP-GFP质粒为模板扩增PFl7R-BiTE-FAP基因。所用引物序列：PFl7R-FAP，上游5′-TTCAATTTTTGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGAACTCAGGACTCCAATTGGTTTTC-3′，下游：5′-ATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCACGCCCGTTTTATTTCCAGCT-3′。PCR扩增程序：98℃20 s；98℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 30 s；72℃ 5 min；30个循环。将痘病毒早晚期启动子 PSEL、EcoR V位点分别引入DsRed基因的上下游引物，而NotⅠ位点和痘病毒特异性启动子F17R分别引入BiTE-FAP基因的上下游引物。pSEL2N1质粒原来的DsRed和GPT基因阅读框用NotⅠ和EcoR V双酶切切去。PCR产物、pSEL2N1骨架质粒 DNA片段切胶回收。将DsRed和BiTE-FAP基因用 Infusion克隆法插入pSEL2N1质粒，构建表达红色荧光的重组质粒pSEL2N1-BiTE-FAP。

1.3 重组病毒rVVDD-BiTE.FAP的构建

消化CV-1细胞，以3.0×105/孔密度接种于6孔板，当细胞汇合度达80%时，将原培养液更换为2 mL含2%胎牛血清的培养基，用MOI值为0.05的vSC20感染，37℃，5%CO2培养箱培养2 h后，将感染液更换为完全培养基，利用Lipofectamine 2000将重组质粒 pSEL2N1-BiTE-FAP转染 CV-1细胞。37℃，5%CO2培养箱培养48 h后，荧光显微镜下观察DsRed的表达，以确定质粒转染和病毒转导效果。细胞完全病变时收集细胞及培养液，反复冻融3次，1 000×g离心10 min，收集病毒上清液，保存于-80℃冰箱。

1.4 重组病毒的筛选和纯化

消化HuTK-143B细胞，以3.0×105/孔密度接种于6孔板；当汇合度达90%时，将原培养液更换为2 mL含2%胎牛血清的培养基，然后分别加入1、10、50μL病毒上清液，置细胞培养箱培养2 h后弃感染液；将含50μg/mL BudR的完全培养基和1%低熔点琼脂糖加入6孔板中覆盖细胞，继续培养48 h。荧光显微镜下观察红色荧光，并将DsRed阳性的病毒斑挑于1 mL PBS中；-80℃冰冻及37℃恒温水浴融解3次后4℃1 000×g离心30 min，收集上清液进行下一轮空斑纯化。经过5轮筛选及纯化后，在荧光显微镜下验证其纯度。

1.5 重组病毒滴度的检测

消化CV-1细胞，以1.5×105/孔密度接种于24孔板培养，分为6组，每组设3个复孔；当汇合度达90%时，取6份1μL病毒液，按比例（10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8）稀释后加入24孔板中；37℃5%CO2培养48 h后弃上清液，加入适量结晶紫染液染色5 min，PBS洗2次后风干，以空斑数计算重组病毒的滴度。

1.6 重组病毒体外复制能力检测

LLC、LL/2细胞经0.25%胰酶消化后，分别以1×105/孔细胞密度接种于48孔板，每种细胞分2组，每组设3个复孔，共种4块板。细胞培养过夜，当达90%汇合度时，用MOI=0.1的rVVDD-BiTE.FAP和亲本病毒vSC20分别感染LLC、LL/2细胞，并在0，24，48，72 h收获，反复冻融3次后通过CV-1细胞空斑计算病毒滴度。

1.7 MTS法检测两株重组病毒的体外溶瘤能力

LLC细胞经0.25%胰酶消化后，将细胞分为5组，均以细胞密度1×104/孔接种于96孔板中，每组设3个复孔，培养过夜。当细胞达90%汇合度时，将rVVDD-GFP和rVVDD-BiTE.FAP按 MOI值（0，0.01，0.1，1和10）稀释后加入96孔板，37℃，5%CO2培养箱培养48 h后，弃培养基，加入100μL新培养基，另设3孔空白对照组（不含细胞及病毒）作为调零孔。将MTS试剂按MTS∶PMS=20∶1的比例混合，并计算所需总体积。每孔加入配置好的混合液20μL，避光置于37℃，5%CO2培养箱培养，1～2 h后用酶标仪检测490 nm处的D值。细胞存活率=（病毒感染孔D值-凋零孔D值）/（对照孔D值-凋零孔D值）×100%。

1.8 结晶紫染色观察活细胞数量

将“1.7”中培养板细胞弃上清液，用PBS轻洗1～2次，吸去PBS，加入适量结晶紫染液，室温放置固定5 min后，再用PBS洗2次，每次静置2 min，完全吸去PBS后于生物安全柜内风干，拍照记录结晶紫染色结果，其颜色深浅代表活细胞数量。

1.9 痘病毒基因组制备及PCR鉴定

吸取20μL的病毒液，按照TaKaRa公司病毒基因组纯化试剂盒的操作步骤抽提基因组DNA，并采用酶标仪定量。确认浓度后取出2 ng作为模板插入基因组片段 PCR，上游引物：5′-CGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGG-3′，下游引物：5′-CGGTGGCACCATCTAATATACCGTGTCGCTGT-3′。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4 min，反应30个循环后72℃再延伸5 min，然后4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.10 小鼠脾脏T细胞的制备

取6周龄C57雄性小鼠1只，断颈法处死，解剖取出脾脏，置于灭菌筛子上，加少量PBS，用10 mL注射器的推进器橡胶头小心研磨，再用PBS冲洗筛子，收集T细胞，置于15 mL离心管中。在管中按1∶1的比例加入红细胞裂解液，置冰上5 min，然后以500×g离心5min，去上清液后用PBS重悬，再离心、重悬1次。T细胞第3次离心后用含10%FBS的RPMI 1640培养基重悬，以2.5×106/mL细胞密度接种于培养皿，最后将刀豆蛋白A（Con A）以2.5 μL/mL加入培养皿用于活化T细胞。

1.11 重组病毒对过表达FAP的小鼠LLC细胞杀伤作用测定

先采用Con A活化小鼠脾脏T细胞。然后将MOI=5的rVVDD-BiTE.FAP感染LLC细胞，24 h后收集上清液，离心后用0.1μm滤膜过滤。将病毒过滤液在有或无活化T细胞的情况下分别与LLC-GFP或LLC-FAP细胞共培养。以无病毒过滤液的空培养液作为对照。具体步骤：LLC-GFP和LLC-FAP细胞经0.25%胰酶消化后，分别以2×104/孔细胞密度接种于96孔板中，每种细胞分为与T细胞、无T细胞共培养两大组，每大组分3个小组，每小组设3个复孔，效应细胞∶靶细胞=3∶1，病毒过滤液∶培养基=40μL∶60μL，37℃，5%CO2培养箱培养24 h后在显微镜下观察杀伤效果，然后用MTS和LDH实验测定杀伤效果。LDH实验参照说明书进行，设立未处理细胞组作为LDH本底释放对照组（低对照），在细胞中加Triton X-100作为LDH完全释放对照组（高对照）。LDH测定方法：将经病毒和T细胞处理的LLC细胞培养板以250×g离心10 min后，小心地从每个孔中取出100μL上清液并转移到光学透明96孔板的相应孔中，向每个孔中加入100μL反应混合物，在室温避光孵育30 min内，用酶标仪测定490 nm处D值。细胞毒性（抑制率）=（实验孔D值-低对照D值）/（高对照D值-低对照D值）×100%。重复上述杀伤实验并吸取上清液，按ELISA试剂盒说明检测上清液中的细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度。

1.12 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件分析数据。实验结果用均数±标准差（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒构建及重组溶瘤痘病毒基因组PCR验证

PCR扩增胶回收的DsRed-PCR产物、FAP-PCR产物和pSEL2N1质粒双酶切产物经电泳检测，结果与理论值相符。见图1。将构建好的质粒经酶切筛选后送上海生工生物工程公司测序验证，获得阳性重组质粒pSEL2N1-BiTE-FAP。

取出2 ng纯化好的重组病毒基因组作为模板，插入基因组片段进行PCR。PCR程序结束后进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果与理论值相符，且未在电泳图上看到亲本病毒vSC20 PCR条带位置处有明显条带扩增，说明已获得高纯度重组病毒。见图2。

图1 pSEL2N1-BiTE-FAP重组质粒构建电泳图

图2 重组病毒rVVDD-BiTE.FAP的PCR鉴定

2.2 BiTE-FAP表达不影响病毒复制和溶瘤能力

空斑法测定结果显示，rVVDD-BiTE.FAP、vSC20感染LLC、LL/2细胞后，各时点的病毒滴度无明显差异，表明重组痘病毒的复制能力未受到影响。见图3。

图3 vSC20、rVVDD-BiTE.FAP感染两类小鼠肺癌细胞株不同时间后滴度

MTS实验结果显示，随着MOI值增加，两类病毒感染后的LLC细胞存活率均逐渐降低，且各滴度的两者溶瘤能力均无显著差异（P均＞0.05，图4）。结晶紫染色也显示上述趋势（图5）。

图4 MTS实验检测不同MOI值重组病毒对LLC细胞存活率的影响

2.3 rVVDD-BiTE.FAP联合小鼠T细胞具有高效抗癌作用

MTS实验结果显示，在与小鼠T细胞共培养的LLC-FAP体系中，rVVDD-BiTE.FAP具有明显抗肿瘤效果，溶瘤效果明显强于其他组（图6）。结果说明BiTE-FAP介导T细胞杀伤FAP阳性肿瘤细胞。

图5 两类重组病毒不同MOI值下的溶瘤能力（结晶紫染色）

图6 MTS检测各组LLC细胞的存活率

LDH结果也显示，rVVDD-BiTE.FAP联合小鼠T细胞，对LLC-FAP细胞具有更强的毒性作用（图7）。对共培养体系的上清液进行ELISA检测，结果显示rVVDD-BiTE.FAP能介导T细胞杀伤肿瘤细胞并释放大量细胞因子IL-2和IFN-γ（图8），T细胞杀伤靶细胞后细胞因子IL2和IFN-γ表达量明显升高（P＜0.05）。

图7 rVVDD-BiTE.FAP和rVVDD-GFP病毒对LLC-GFP和LLC-FAP细胞的抑制作用

3 讨论

肿瘤微环境是具有异质成分的复杂环境，在肿瘤发生、发展以及介导治疗抗性中起重要作用［7-10］，因此，除了靶向癌细胞之外，靶向肿瘤微环境中的辅助细胞可以增加靶向治疗的有效性［11］。FAP阳性癌相关成纤维细胞是肿瘤基质的中心细胞组分，并且对免疫抑制、基质发生、血管形成和细胞外基质重塑具有重要的促进作用［12］。Ostermann等［13］的临床前研究显示，靶向FAP的单克隆抗体能够破坏肿瘤组织的成纤维细胞和血管结构，抑制肿瘤生长，而实验小鼠无明显毒副反应。然而，在临床试验中输注FAP特异性单克隆抗体，患者未能从中获益［14］。Tran等［15］报道，靶向 FAP的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）在小鼠实验中却出现致死性骨毒性和恶病质的毒副反应，主要原因在于小鼠PDGFR-α和Sca-1阳性的多能骨髓基质细胞也大量表达FAP，导致CAR-T细胞出现脱靶作用。因此，在肿瘤微环境局部表达FAP抗体可避免T细胞出现这种脱靶副反应。VGF和TK双缺失的溶瘤痘病毒不但具有肿瘤组织趋向性，而且能够高水平表达外源插入基因。该研究旨在通过rVVDD-BiTE.FAP将FAP双特异性抗体表达于肿瘤局部，避免T细胞的脱靶副反应。

图8 ELISA法检测共培养体系中IL-2和IFN-γ浓度

本研究将构建成功的重组溶瘤痘病毒rVVDDBiTE.FAP进行纯化后，与Con A活化的T细胞共培养，检测其对FAP过表达的LLC细胞的体外杀伤效果。结果显示，重组病毒不仅保留了原本病毒体外复制及溶瘤能力，而且对FAP过表达细胞具有更强的杀伤作用。由于传统疗法治疗实体瘤效果欠佳，携带靶向FAP双功能抗体的溶瘤痘病毒不仅能够裂解肿瘤细胞，而且能够介导T细胞靶向杀伤肿瘤基质细胞，这种双靶向治疗机制为肿瘤治疗提供了新思路。本研究证实了表达双功能抗体的重组溶瘤病毒的体外杀伤能力，后期我们将在小鼠体内进一步证实该研究的可行性。