血浆lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1表达对非小细胞肺癌的诊断价值

王宁新，陈萍*，李坚，吕梦佳，汪毅

（江苏大学附属医院1.呼吸内科，2.中心实验室，江苏镇江212001）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的5年生存率不足20%［1］。及时发现并干预肺癌病灶，有助于降低肺癌患者死亡率，延长生存期。因此探寻高敏感性、高特异性的诊断NSCLC的生物标志物依旧是肺癌防治领域研究的重点和热点。近年来长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为一种参与癌症生物学的遗传分子备受关注。多种lncRNA在肿瘤组织中异常表达，参与肿瘤的发展过程［2］。已有研究表明，肺癌组织中lncRNA生长停滞特异性转录本5（growth arrest-specific transcript5，GAS5）的表达低于正常肺组织［3］，而lncRNA-CCAT1的表达则高于正常肺组织［4］。然而，关于这两类lncRNA在血浆中的表达水平研究较少。本研究选取了NSCLC及良性肺病患者各60例作为研究对象，通过实时荧光定量PCR检测血浆lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1的表达水平，分析其与相关临床病理参数的关系，探讨其用于诊断NSCLC的临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年9月至2018年6月本院呼吸内科住院NSCLC患者60例作为NSCLC组，其中男39例，女21例，年龄38～78岁；病理组织分型：肺腺癌39例，肺鳞癌21例。根据2017年国际抗癌联盟（UICC）肺癌TNM分期（第8版）标准，该组临床分期Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期46例，另有10例临床分期不能明确。NSCLC入选标准：①均经病理组织学或细胞学确诊；②均为新发病例，排除肺部转移性肿瘤者，均未接受过手术、放疗、化疗或靶向治疗。选取同期肺部良性疾病患者60例作为良性肺病组，其中男46例，女14例，年龄25～81岁，病种包括肺炎26例，慢性阻塞性肺疾病19例，支气管扩张15例。

为评价试验结果的稳定性，另外选取20例健康人用于血浆lncRNA检测结果的校对。本研究符合人体试验伦理学标准，并得到医院伦理委员会批准，所有受试者在收取标本前均已阅读并签署知情同意书。

1.2 试剂及相关仪器

分离血浆RNA时使用美国Thermo SL 16R水平冷冻离心机、美国Thermo MICRO 21R高速冷冻离心机。血浆总RNA提取试剂为Trizol®Reagent（美国Invitrogen公司）。反转录合成cDNA时使用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒（大连宝生物公司）、美国Bio-Rad Mycycler PCR仪。实时荧光定量PCR使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒（大连宝生物公司）、美国Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪。

1.3 血浆标本的收集与处理

用无菌针管抽吸受试者全血4 mL，置于乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝试管中，TDL-S台式低速离心机内3 000 r/min离心10 min，提取血浆400μL，用1.5mL无RNA酶的EP管进行分装，长期冻存于超低温冰箱（-80℃）。同时采集每位受试者2 mL的血液标本送核医学科检测癌胚抗原及Cyfra21-1（试剂盒说明书标明的癌胚抗原和Cyfra21-1正常上限分别为5μg/L和7μg/L）。

1.4 血浆RNA的提取及cDNA的合成

400μL血浆标本冰面融化后，严格按照RNA提取试剂盒说明书提取血浆总RNA，浓度及纯度使用U-2800紫外分光光度仪测定，收集的血浆总RNA可置于-80℃长期保存。取固定体积的血浆总RNA，按照反转录试剂盒操作说明书反转录成cDNA，合成的cDNA置于-20℃长期保存或者立即用于后续实时荧光定量PCR检测。

1.5 实时荧光定量PCR检测lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1的表达

取2μL cDNA作为模板，按照 TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒步骤配制荧光定量PCR反应体系，最后在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上检测lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1的表达水平。反应条件：95℃预变性30 s，随后95℃ 5 s，60℃5 s，共40个循环。每个样本的每个检测基因均设置3个复孔，并根据熔解曲线判断是否为特异性产物。选用GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算两类lncRNA的相对表达量。使用的引物序列：

GAPDH上游引物为5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′，下游引物为5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′；lncRNA-GAS5上游引物为5′-AGCAAGCCTAACTCAAGCCATTGG-3′，下游引物为5′-ATTAAGCTGGTCCAGGCAAGTTGG-3′；lncRNA-CCAT1上游引物为5′-TGCTCACCTTACTGCCTGAGC-3′，下游引物为5′-GGAGCGCACAACCTAGATCC-3′。

1.6 统计学分析

使用SPSS 22.0进行统计分析，数据均以均数±标准差的形式表示，组间比较使用levene法检测方差齐性，方差齐时，使用t检验；方差不齐，使用近似t检验。使用受试者工作特征（ROC）曲线及曲线下面积（AUC）评估两类lncRNA的诊断效能，各组数据以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者血浆lncRNA-GAS5和lncRNACCAT1表达水平

与良性肺病组比较，NSCLC患者血浆中lncRNA-GAS5表达显著下调（t=-5.379，P＜0.05），lncRNA-CCAT1表达水平明显上调（t=5.721，P＜0.05）。见图1。

图1 非小细胞肺癌患者血浆lncRNA-GAS5与lncRNA-CCAT1表达水平

2.2 NSCLC患者血浆lncRNA-GAS5和lncRNACCAT1表达水平与临床病理参数的关系

根据统计学资料，NSCLC患者血浆lncRNAGAS5表达水平与年龄、性别、组织分型以及临床分期无关，但与吸烟史相关（P=0.013）；而lncRNACCAT1的表达与年龄、性别、吸烟史、组织分型以及临床分期均无相关性（P均＞0.05）。见表1。

2.3 血浆 lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1诊断NSCLC的效能比较

ROC曲线分析显示，单独检测时，lncRNAGAS5、lncRNA-CCAT1的AUC分别为0.772（标准误为0.042，95%CI为0.690～0.855）和0.762（标准误为0.043，95%CI为0.678～0.846），而癌胚抗原、Cyfra21-1的AUC分别为0.737（标准误为0.045，95%CI为0.649～0.826）和0.735（标准误为0.045，95%CI为0.646～0.824），4种指标的AUC无明显区别（图2a）。lncRNA-GAS5与lncRNA-CCAT1联合诊断时的AUC为0.772（标准误为0.042，95%CI为0.690～0.854），与单独检测 lncRNA-GAS5的AUC相等，但高于单独检测lncRNACCAT1的AUC（图2b）。

lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原三者联合诊断时的AUC为0.870（标准误为0.032，95%CI为0.807～0.934），lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、Cyfra21-1三者联合诊断时的AUC为0.840（标准误为0.034，95%CI为0.772～0.908）。与单指标及两个指标联合诊断相比，联合传统标志物后AUC提高，联合癌胚抗原诊断的敏感性显著升高。根据ROC曲线，找到诊断NSCLC的折点（cut off），并依此计算出敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性。结果见表2。

图2 血浆lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1诊断NSCLC的ROC曲线

表2 血浆lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1对NSCLC的诊断效果

3 讨论

lncRNA是一类结构类似mRNA、长度大于200个核苷酸的不具有可读框的转录本，可调节细胞分化、增殖、代谢和凋亡等生物学过程，在包括肿瘤等多种疾病发生中扮演重要角色［5-6］。近年来发现lncRNA在多种层面调节基因的表达，并且lncRNA本身也可具有癌基因和抑癌基因的作用。一些lncRNA可在肿瘤中特异性表达，不同肿瘤可能具有不同的lncRNA表达谱［7-9］，因此lncRNA有可能作为包括肺癌在内各种癌症诊断和治疗的靶点。

Huang等［10］用 RNA深度测序（RNA-seq）技术检测外泌体中的RNA，结果显示从血浆中分离获得的外泌体中除有大量miRNA外，还有一些lncRNA（约占3.36%），这为外周血中存在lncRNA提供了直接依据。后续很多相关实验也再次验证了这个发现，如Zhang等［11］在乳腺癌患者及健康患者血浆中检测到H19的表达，并证明其可作为乳腺癌早期筛查和预后监测的潜在生物标志物。杨哲峰等［12］的研究显示，血浆lncRNA-HEIH的表达与肝癌发生风险呈显著正相关。上述研究均提示测定血浆中lncRNA对于肺癌的诊断具有可行性。

lncRNA-GAS5在乳腺癌、胃癌、前列腺等多种癌症中下调［13-15］。有研究显示［3］，肺癌组织中 lncRNA-GAS5的表达水平显著低于正常肺组织，肺癌细胞株中lncRNA-GAS5的表达水平明显低于正常支气管上皮细胞。Zhang等［16］亦发现，与邻近正常组织比较，NSCLC组织中lncRNA-GAS5表达水平明显降低；并且lncRNA-GAS5可抑制自噬，从而增强NSCLC细胞中的顺铂敏感性。Liang等［17］的研究显示，NSCLC患者血浆lncRNA-GAS5表达较健康者显著降低，而术后第7天较术前明显升高。Shi等［18］评估了lncRNA-GAS5表达与临床病理学参数的相关性（主要为肿瘤分期及是否淋巴结转移），发现具有较高肿瘤负荷的较大肿瘤或更晚期的肿瘤中表达lncRNA-GAS5水平更加低下。上述研究表明，lncRNA-GAS5可能成为一个较好的诊断早期NSCLC的分子标志物。当然，lncRNA-GAS5并不是在所有的恶性疾病中都呈下调。有研究表明，血浆中lncRNA-GAS5表达水平的增加与多发性骨髓瘤密切相关［19］，这可能是由于不同疾病中lncRNA分泌途径的差异所导致。

lncRNA-CCAT1最早于2012年在结肠癌中被发现［20］，其在结肠癌组织中的表达比在正常组织中高数倍，而其在染色体上位于转录因子c-Myc附近。但作为一种新型lncRNA，相关研究较少。Li等［21］发现lncRNA-CCAT1在57个胃癌组织样本中的表达高于邻近正常组织，并进一步分析推测lncRNACCAT1通过负调节miR-219-1促进胃癌发生和进展。另外，lncRNA-CCAT1被证实在肝细胞癌中的表达高于癌旁组织，其作用机制与c-Myc有关，同时lncRNA-CCAT1可作为“分子海绵”与miRNA let-7结合并拮抗其功能，最终促进肝癌细胞的增殖与侵袭［22］。而在肺癌方面，White等［4］对 567例肺腺癌与肺鳞癌转录组进行测序，经综合分析得到了肺癌中失调lncRNA图谱，在异常表达的111种lncRNA中包括了CCAT1（在两组肺癌细胞株中表现为高表达）。Lu等［23］发现香烟烟雾提取物能诱导lncRNACCAT1表达增加，而 lncRNA-CCAT1与miRNA let-7c竞争性结合降低了对其靶基因c-Myc的下调，而c-Myc又能反过来作用于lncRNA-CCAT1启动子区上调其表达，最终这种相互作用引起人类支气管上皮细胞周期的改变，促进支气管肺癌的发生。本研究结果显示，与良性肺病患者比较，NSCLC患者血浆lncRNA-GAS5表达显著下调，而lncRNA-CCAT1则表现为显著上调。进一步结合临床资料分析显示，NSCLC患者lncRNA-GAS5表达水平与年龄、性别、组织分型、分期无关，但与吸烟史相关（P=0.013），而lncRNA-CCAT1的表达与年龄、性别、吸烟史、组织分型、分期均无相关性。其次，我们发现单独检测 lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1，其 AUC仅略高于癌胚抗原及Cyfra21-1，同时根据ROC曲线选取的折点处的敏感性均高于癌胚抗原及Cyfra21-1，但特异性略有不及。联合检测lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1时AUC无明显改变，敏感性进一步得到提升，特异性却更加下降。高敏感性的标志物更加适用于筛选试验，但诊断试验更注重高特异性，lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1联合传统肿瘤标志物时诊断效能增加，且敏感性得到明显提升，特异性保持良好。因此，lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1有潜力与传统肿瘤标志物联合应用，成为NSCLC患者筛选及诊断的分子标志物。

本研究结果表明，在NSCLC患者及良性肺病患者血浆中lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1均呈差异性表达，但在分析这两类基因表达与肺癌分期及肺癌病理分型关系时未发现明显相关性，单独检测或两者联合检测用于诊断时的AUC与传统肿瘤标志物相比无明显增加，与其他研究结果不符［17，21］。考虑有以下几个方面原因：①样本量不足，可能存在抽样误差。②样本相关特征分布不均：本研究中，大多数患者分布在Ⅲ期和Ⅳ期，Ⅰ和Ⅱ期仅4例，无法分析这两个指标能否在早期诊断NSCLC中发挥优异表现。③临床资料收集不完全：很多NSCLC患者不愿行相关检查（如PET-CT），导致无法分期。④未考虑并发症的影响：在阅读相关文献时，我们发现，许多lncRNA不仅与恶性疾病相关，同样在良性疾病中也起重要作用，本研究的两个基因也是如此，这更加对我们的研究添加了许多干扰因素。因此，在后续实验中，我们将扩大样本量，注意挑选合适样本，排除相关干扰因素，为进一步证明血浆lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1在NSCLC诊断中的临床应用价值提供更有说服力的证据。

综上所述，我们的研究结果显示lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1在血浆中能够被检测，且在NSCLC患者和良性病变患者血浆中的表达差异具有统计学意义，这两种基因在诊断NSCLC时具有一定的准确性，联合诊断时能获得较高的敏感性。由于目前NSCLC的确诊仍需依靠病理学结果，因此，我们认为lncRNA-GAS5及lncRNA-CCAT1联合诊断能在NSCLC筛选试验中得到良好效果。