谷子NCED基因家族鉴定及其干旱胁迫响应表达模式分析

程鸿燕 郭昱 马芳芳

摘要：基于转录组数据分析并结合谷子基因组数据库鉴定出10个候选NCED基因，对它们的结构特点、理化性质、启动子元件功能等进行分析，并以抗旱（GG）和干旱敏感谷子品种（JF16）为材料，对PEG胁迫前后差异基因的表达特点进行分析。结果表明，谷子中编码NCED家族基因启动子中含较多与抗旱胁迫相关的功能元件;经PEG胁迫处理后，Seita.2G035400在GG和JF16中表达量均上调，但上调幅度有所差异。该研究结果进一步加强了对植物NCED基因家族的了解，也为后续进行谷子抗旱机制和抗旱分子育种提供了理论借鉴依据。

关键词：谷子;NCED家族基因;干旱胁迫;表达;生物信息学

中图分类号： S515.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0040-04

谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]是禾本科狗尾草属的粮草兼用作物，最早被驯化种植于中国北方，已有8 700多年的栽培史[1]，其营养价值高，富含人体所需的类胡萝卜素、氨基酸、叶酸和硒等成分[2]，至今仍被誉为“五谷之首”。谷子叶面积小、自花授粉、蒸腾效率和水分利用效率高，具有耐干旱、耐贫瘠特性[3]。但是近年来，随着全球气候变暖，可利用水资源日趋匮乏，干旱成为制约作物正常生长发育的关键因素之一。

发掘谷子耐旱基因，了解其基因家族在干旱胁迫条件下的表达模式，对谷子抗旱新品种选育具有极为重要的指导作用。作物在干旱、盐碱、低温、冻害等非生物胁迫条件下，可通过自身调节来适应或抵制这些胁迫[4-5]。脱落酸（abscisic acid，ABA）作为一种植物激素，是一种极为重要的逆境信号，不仅在植物生长发育过程不同阶段起重要作用，而且在干旱、低温、衰老、盐渍等多种逆境响应中起着重要调控作用，可通过介导叶片气孔关闭过程来抵御干旱胁迫[6-7]。

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）属于类胡萝卡素双加氧裂解酶 （carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）家族成员，被认为是高等植物ABA生物合成过程中最重要的限速酶，有研究表明其表达量与植物体内ABA含量呈正相关[8-10]。编码NCED的基因最初是从玉米突变体viviparousl4（vpl4）中被克隆[11]，随后在其他植物如番茄[12]、豇豆[13]、拟南芥[8，14]、柱花草[15]等中也克隆得到了NCED基因。近年来，我国在NCED响应小麦、拟南芥、花生、烟草、水稻等作物干旱胁迫的研究中发现，干旱胁迫可以诱导NCED基因表达和内源ABA的积累，且在一定范围内，该基因表达与ABA积累随脱水延长而明显增强[16-20]，这说明NCED基因在提高植物抗旱能力方面具有重要研究价值。

谷子是重要的抗逆模式作物，目前，尚无对谷子中NCED家族进行系统研究的相关报道，干旱胁迫下谷子NCED基因家族情况及其结构特点和表达特征并不明晰。本研究以耐旱品种勾勾母鸡咀（GG）和干旱敏感品种晋汾16（JF16）为试验材料，在人工气候室模拟昼夜条件对其进行培养，于苗期进行20%聚乙二醇6000（PEG-6000）模拟干旱处理后取材，用于表达谱测序。从中找到抗旱相关基因NCED后，利用生物信息学方法从谷子基因组数据库中鉴定同源NCED基因，并系统分析其基因家族成员的结构特点、理化特性、启动子调控元件、进化关系以及该基因家族成员在干旱胁迫下的表达特点，旨在为进一步研究谷子抗旱分子育种提供有用信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用植物材料为耐旱性品种勾勾母鸡咀（GG）和干旱敏感性品种晋汾16（JF16），均由山西农业大学农业生物工程研究所提供。将这2个品种种植在混合均匀的基质（营养土 ∶ 蛭石=3 ∶ 1）上，然后将其放于人工气候室，模拟外界昼夜条件进行14 h光培养（28 ℃）和10 h暗培养（23 ℃），出苗培养21 d后，将2个品种谷子幼苗用一定量的20% PEG-6000模拟干旱胁迫处理0.5 h，而对照组幼苗用同等量的蒸馏水处理相同时间。之后在对照组和处理组中的每个品种中分别随机取出3株幼苗，进行RNA提取和表达谱测序。

1.2 试验方法

根据表达谱测序结果查询到NCED基因名，并通过查阅相关文献和代谢途径，明确其注释功能;利用Phytozome v 12.1（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）基因组数据库进行搜索，查找NCED基因家族信息。利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）软件进行基因结构分析;利用ExPASY（https：//web.expasy.org）软件对谷子NCED基因家族的蛋白质分子量和理论等电点等理化性质进行预测分析;利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测谷子NCED基因家族启动子（基因上游1 500 bp序列）相关元件并进行统计;采用MAGA 7.0软件对谷子NCED蛋白及拟南芥、水稻、小麦和玉米等近源物种中NCED蛋白构建进化树，进行亲缘关系比对。

2 结果与分析

2.1 谷子NCED基因的基本信息及结构分析

在Phytozome v12.1的谷子数据库中找到10个NCED家族基因，并對其基本信息（染色体位置、CDS序列和氨基酸序列）进行统计与分析，结果发现，谷子NCED家族基因分布在不同的染色体上，其中1号、4号和9号染色体上各包含1个成员，2号和3号染色体上各包含2个成员，5号染色体上的NCED家族基因最多，为3个（表1）。谷子NCED家族基因CDS序列的平均长度为1 773 bp，不同成员的CDS序列长度之间也存在差异，其中Seita. 9G156500的CDS序列最长，为1 965 bp;Seita. 3G408300的CDS序列最短，为1 638 bp（表1）。

为进一步分析谷子NCED家族基因的结构特征，使用GSDS 2.0软件对NCED家族成员的基因序列和CDS序列进行结构分析，结果显示，NCED家族不同成员之间的结构存在较大差异，其中Seita. 2G035400和Seita. 3G391000具有相同的结构，都没有内含子和上下游，只有编码区序列;其余8个基因都含有内含子和编码区序列，但数目差异较大，并且Seita. 1G288400和Seita. 4G062800与其余6个基因结构差异更大，未发现上下游结构（图1）。

2.2 谷子NCED理化性质

根据豫谷1号NCED的cDNA序列预测到的氨基酸序列可知，谷子NCED家族基因氨基酸序列的平均长度为590 aa，而不同成员的氨基酸序列长度之间存在差异，其中Seita. 9G156500的氨基酸序列最长，为654 aa;Seita. 3G408300的氨基酸序列最短，为545 aa（表1）。蛋白质分子量在 60 585.91～70 862.56 ku之间，平均值为64 656.88 ku，其中Seita. 9G156500的蛋白质分子量最大（70 862.56 ku），Seita. 5G315700的蛋白质分子量最小（60 585.91 ku）;等电点介于5.81（Seita. 4G062800）～7.66（Seita. 5G315700）之间，均值为6.37，并且除Seita. 5G315700的蛋白质等电点呈弱碱性外，其余9个均呈酸性，可见它们发挥其最大催化活性的最适pH值有所差异（表1）。

2.3 谷子NCED基因家族系统进化树

为进一步分析谷子NCED基因家族之间及其与其他植物NCED之间亲缘关系的远近，了解其进化过程，将所得到的谷子NCED基因编码的蛋白序列与其他物种（水稻、玉米、高粱、拟南芥、大麦、小麦和狗尾草）进行BLAST蛋白同源性检索，并下载其他物种的NCED蛋白序列，之后将其与谷子NCED基因家族成员进行比对，并构建进化树（图2）。结果发现，谷子NCED基因家族中，Seita. 5G315800、Seita. 5G315600和Seita. 5G315700单独聚为一大类，暗示这3个基因虽然与谷子中一些基因亲缘关系较近，但在进化过程中它们所编码的蛋白序列存在较多氨基酸变异位点;而其余7个基因与其他7个物种的NCED聚为一大类，说明谷子的这7个基因亲缘关系较近，并且在这一大类中，谷子Seita. 2G035400与狗尾草中NCED基因 （Sevir. 2G040100）是相同的，它们与高粱的NCED亲缘关系最近，与水稻、小麦的亲缘关系次之;谷子Seita. 9G156500与大麦NCED的亲缘关系最近;谷子Seita. 3G391000与玉米NCED的亲缘关系最近;而Seita. 9G156500和Seita. 3G391000与拟南芥NCED的亲缘关系的远近各次于大麦和玉米。这一结果与植物经典分类结果相一致。

2.4 谷子NCED家族基因启动子调控元件功能分析

通过PlantCARE软件对谷子NCED家族基因启动子（基因上游1 500 bp）顺式作用元件进行功能预测，有利于进一步鉴定该家族基因在谷子抗旱机制中所起的作用。本研究主要对激素响应元件和逆境胁迫响应元件进行了统计，结果（表2）表明，每个基因启动子中均含有厌氧诱导响应元件，有部分基因启动子中含有低温响应和热响应元件;除基因Seita. 5G315600外，其余9个基因启动子中均含有ABA响应元件;除基因Seita. 9G156500、Seita. 1G288400和Seita. 3G408300外，其余7个基因均含有MeJA响应元件，并且Seita. 5G315800中最多（为12个）;有5个基因启动子中含有SA响应元件，它们分别是Seita. 3G391000、Seita. 3G408300、Seita. 2G174500、Seita. 5G315600和Seita. 5G315700;除基因Seita. 2G035400、Seita. 9G156500和Seita. 2G174500外，其余7个基因启动子中均含有GA响应元件，并且Seita. 4G062800中最多（为3个）;有5个基因启动子均含有MYB响应元件，它们分别是Seita. 9G156500、Seita. 3G391000、Seita. 2G174500、Seita. 5G315800和Seita. 5G315600。

2.5 谷子NCED家族基因成员在干旱胁迫下的表达模式

对谷子幼苗进行干旱胁迫处理后，根据表达谱测序结果，对勾勾母鸡咀和晋汾16中NCED基因表达量进行分析，这2个品种中均含有Seita.2G035400基因。从图3中可以看出，GG和JF16经不同处理后其体内Seita.2G035400基因均有表达，并且经干旱胁迫处理后该基因的表达量与对照相比均升高，但该基因在干旱敏感性品种JF16中表达量增幅明显高于在耐旱品种GG中表达量增幅（图3）。

3 讨论与结论

脱落酸ABA与植物生长发育调控、气孔开闭以及对逆境适应和抵御之间关系密切，是一种尤为重要的激素调节物质[21-22]。因此，有必要分析ABA生物合成关键基因，明确其家族基因结构与功能，掌握其在ABA生物合成中所起作用，进而通过调控植物体内ABA含量来达到植物自身生理调控目的。NCED基因就是参与ABA生物合成调控的一类关键基因[9]。

从谷子NCED家族基因启动子元件功能预测发现，有很多调控元件与植物干旱胁迫响应物质有关，如ABRE和motif IIb（CCGCCGCGCT）是ABA响应元件，而ABA可通过调节气孔开闭或者促进根系对水分吸收等途径来调控植物对干旱胁迫的适应性，Neill等研究认为，ABA是植物的抗逆诱导因子[23];CGTCA-motif和TGACG-motif为茉莉酸甲酯（methyl-jasmonate，MeJA）响应元件，而研究报道MeJA在代谢和生理调控上类似于植物激素脱落酸的作用[24]，它可以提高作物抗旱性[25];TCA-element是水杨酸（salicylic acid，SA）响应元件，水杨酸是植物内源信号分子之一，可通过减少植物体内细胞自由基积累和减轻细胞膜脂过氧化等途径来缓解干旱胁迫对植物自身的影响。陶宗娅等通过对干旱胁迫下的小麦外施一定浓度的SA发现，SA具有缓解干旱作用[26];TATC-box是赤霉素（gibberellin acid，GA）響应元件，用一定浓度GA对烟草种子进行引发处理后可提高其种子和幼苗的抗旱性[27];MBS（TAACTG和CAACTG）是MYB转录因子结合位点响应元件，MYB转录因子与植物抗逆胁迫有关，据报道，拟南芥中ATMYB41在干旱、ABA和盐胁迫处理下高水平表达[28]。此外，HSE（AAAAAATTT）和LTR（CCGAAA）分别是热胁迫和低温胁迫响应元件，TC-rich repeats（ATTCTCTAAC）是胁迫调控相关元件。因此可以推测谷子生长发育过程中通过这些调控元件共同作用来响应干旱、低温等逆境胁迫。

從本试验中对NCED家族中Seita.2G035400基因表达量的分析可以看出，在正常浇水条件下，2个品种谷子GG和JF14中Seita.2G035400表达量很低或者几乎不表达，干旱胁迫后诱导该基因大量表达（图3），说明该基因响应干旱胁迫，并且在耐旱品种与干旱敏感品种中所起作用相同，只是由于表达量的差异而引起这2个谷子品种的抗旱能力不同。这与前人研究结果相一致，前人研究报道已证明NCED基因经干旱胁迫后大量表达，并通过调控植物内源ABA含量来抵御干旱胁迫[14，29-30]。

综上所述，本研究基于PEG胁迫后谷子表达谱数据和Phytozome谷子基因组数据库，鉴定出10个谷子NCED基因，运用生物信息学方法对其基本信息、结构特点、蛋白理化性质和启动子元件功能等进行了分析预测，并对其中一个基因Seita.2G035400在干旱胁迫条件下的表达模式进行了分析，研究结果为谷子抗旱分子育种提供了理论借鉴基础，后期研究有望通过克隆谷子中NCED基因，利用转基因技术使其在谷子中过量表达，并通过耐旱性筛选试验来验证基因功能。

参考文献：

[1]李荫梅. 谷子育种学[M]. 北京：中国农业出版社，1997：421-446.

[2]Muthamilarasan M，Prasad M. Advances in setaria genomics for genetic improvement of cereals and bioenergy grasses[J]. Theoretical and Applied Genetics，2015，128（1）：1-14.

[3]Diao X，Schnable J，Bennetzen J L，et al. Initiation of setaria as a model plant[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2014，1（1）：16-20.

[4]Hu H，Xiong L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops[J]. Annual Review of Plant Biology，2014，65（1）：715-741.

[5]Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2002，53：247-273.

[6]Cutler S R，Rodriguez P L，Finkelstein R R，et al. Abscisic acid：emergence of a core signaling network[J]. Annual Review of Plant Biology，2010，61（1）：651-679.

[7]Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. Gene networks involved in drought stress response and tolerance[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（2）：221-227.

[8]Tan B C，Joseph L M，Deng W T，et al. Molecular characterization of the Arabidopsis 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2003，35（1）：44-56.

[9]Ren H，Gao Z，Chen L，et al. Dynamic analysis of ABA accumulation in relation to the rate of ABA catabolism in maize tissues under water deficit[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（2）：211-219.

[10]Schwartz S H，Qin X，Zeevaart J A. Elucidation of the indirect pathway of abscisic acid biosynthesis by mutants，genes，and enzymes[J]. Plant Physiology，2003，131（4）：1591-1601.

[11]Tan B C，Mccarty D R. Genetic control of abscisic acid biosynthesis in maize[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（22）：12235-12240.

[12]Burbidge A，Grieve T，Jackson A，et al. Structure and expression of a cDNA encoding a putative neoxanthin cleavage enzyme（NCE）isolated from a wilt-related tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）library[J]. Journal of Experimental Botany，1997，48（12）：2111-2112.

[13]Iuchi S，Kobayashi M，Yamaguchi-Shinozaki K，et al. A stress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved in abscisic acid biosynthesis under water stress in drought-tolerant cowpea[J]. Plant Physiology，2000，123（2）：553-562.

[14]Iuchi S，Kobayashi M，Taji T，et al. Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2001，27（4）：325-333.

[15]Yang J，Guo Z. Cloning of a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene （SgNCED1） from Stylosanthes guianensis and its expression in response to abiotic stresses[J]. Plant Cell Reports，2007，26（8）：1383-1390.

[16]李 康，聂小军，方桂英，等. 普通小麦及其近缘种NCED基因的克隆及表达分析[J]. 西北农业学报，2010，19（6）：55-59.

[17]李嘉怡，苏良辰，何月容，等. 超表达AhNCED1拟南芥植株在渗透胁迫下抗氧化能力和抗旱相关下游基因表达变化 [J]. 植物生理学报，2012，48（12）：1167-1172.

[18]胡 博，肖素妮，吕 滟，等. 不同花生品种响应干旱胁迫后叶片内ABA与AhNCED1的分布[J]. 中国细胞生物学学报，2012，34（10）：992-997.

[19]牛志强，刘国顺，师婷婷，等. 烟草NCED3基因的克隆及其干旱胁迫表达分析[J]. 中国烟草学报，2015，21（3）：100-106.

[20]徐学中，汪 婷，万 旺，等. 水稻ABA生物合成基因OsNCED3响应干旱胁迫[J]. 作物学报，2018，44（1）：24-31.

[21]Davies W J，Zhang J. Root signals and the regulation of growth and development of plants in drying soil[J]. Physiol Plant Mol Biol，1991，42（1）：55-76.

[22]And P C，Robertson M. Gene expression regulated by abscisic acid and its relation to stress tolerance[J]. Physiol Plant Mol Biol，1994，45（1）：113-141.

[23]Neill S J，Desikan R，Clarke A，et al. Nitric oxide is a novel component of abscisic acid signaling in stomatal guard cells[J]. Plant Physiology，2002，128（1）：13-16.

[24]刘 新，张蜀秋，娄成后.茉莉酸信号转导及其与脱落酸信号转导的关系[J]. 植物生理学通讯，2002，38（3）：285-288.

[25]Turner J G，Ellis C，Devoto A. The jasmonate signal pathway[J]. Plant Cell，2002，14（l）：S153-S164.

[26]陶宗娅，邹 琦，彭 涛，等. 水杨酸在小麦幼苗渗透胁迫中的作用[J]. 西北植物学报，1999，19（2）：296-302.

[27]坎 平，王莎莎，馬文广，等. 赤霉素引发同时提高烟草种子及幼苗抗旱性和抗冷性[J]. 种子，2014，33（2）：30-34，38.

[28]Cominelli E，Sala T，Calvi D，et al. Over-expression of the Arabidopsis AtMYB41 gene alters cell expansion and leaf surface permeability[J]. The Plant Journal，2008，53（1）：53-64.

[29]Qin X Q，Zeevaart J A. The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96（26）：15354-15361.

[30]Burbidge A，Grieve T M，Jackson A，et al. Characterization of the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its relationship with maize Vp14[J]. The Plant Journal，1999，17（4）：427-431.杜尚广，余 波. 互叶白千层优株筛选及丛生芽诱导培养[J]. 江苏农业科学，2019，47（1）：44-47.