不同浸提时间下野菊花水浸提液对铜绿微囊藻的影响研究

(河南师范大学水产学院，河南新乡 453007)

鱼和渔业产品能够提供维持人体健康的蛋白质和必须微量元素，对维持人体营养均衡有重要意义。水产养殖已成为增加鱼类供应的主要途径和动物食品中增加最快的行业[1]。2018年中国渔业统计年鉴的数据显示：淡水养殖的水产品占淡水产品产量的93.01%，淡水养殖面积占水产养殖总面积的72.02%。其中池塘养殖面积最大，占总的淡水养殖面积的47.12%。因此，在我国，池塘养殖是一种重要的淡水养殖形式。

池塘养殖中，一个健康的藻相尤其重要，藻相的形成和变化主要由浮游生物，特别是浮游植物的变动引起[2]。健康的池塘藻相主要含硅藻和绿藻[3]。但是由于集约化养殖，过量投喂，管理不科学等，养殖水体出现严重的富营养化，导致水体中藻相失衡。浮游植物的群落组成变成蓝藻成为优势种群。目前有毒蓝藻引起的水华会引发很多问题。在养殖池塘中后期容易爆发有害蓝藻水华，首先会破坏池塘藻相结构，抑制有益藻类生存，破坏池塘的生态平衡。其次，蓝藻门微囊藻属的一些藻类大量繁殖会产生毒素。长期暴露于微囊藻毒素的环境中不仅使养殖的水产生物减产，而且会严重影响人类健康，容易导致肝癌、结肠癌、直肠癌等[4-5]。蓝藻产生的某些次生代谢产物被鱼虾吸收到体内积累，破坏口感，影响鱼虾的使用价值。

目前常用的几种治理策略包括物理方法[6]、化学方法[7]和生物方法[8]来调控池塘藻相。常用的物理方法有更换池塘中的水，保证水体干净；多开增氧机来增加水体的流动；也可泼洒一些试剂使藻类絮凝；或者直接人工将水体的藻类打捞出来。物理方法工作量大，成本高。化学方法主要是使用杀藻剂如硫酸铜、漂白粉、石灰等，近些年也有一些综合性的除藻剂被使用。化学方法见效快，成本低，但往往会给水体带来新的污染。生物方法主要有放养一些以蓝藻为食的滤食性鱼类[9]；向水体投放复合微生物来降解水体中的污染物。生物方法常常局限性比较大，而且部分生物会带来生物入侵。总之，亟待找到一种绿色、高效的藻华治理方法。

缓解蓝藻水华的另一种方法是基于化感作用在静水或富营养化水体中使用植物作为杀藻剂。化感作用是植物或者微生物产生化学物质并释放出，对其他生物产生直接或间接的影响。芦苇[10]、凤眼莲[11]、穗花狐尾藻[12]等水生植物，稻草[13]、大麦秸秆[14]等陆生植物对缓解有害藻华藻种有一定效果。我们前期比较马齿苋（Portulaca oleracea）、吊兰（Chlorophytum comosum）、野菊花（Chrysanthemum indicum）、长寿花（Kalanchoe blossfeldiana）、芦荟（Aloe vera）和绿萝（Epipremnum aureum）6种常见陆地植物的抑藻效果，发现野菊花对铜绿微囊藻的抑制作用最强。为了进一步探讨野菊花抑藻的活性成分，本实验比较不同浸提时间对野菊花抑制铜绿微囊藻效果的影响，为下一步应用野菊花控制蓝藻水华提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

实验材料：一株中国科学院淡水藻种库分离出的纯培养铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa ，FACHB-905）。使用的野菊花花蕾产自大别山。

实验仪器：电子天平（500 g/0.01 g），高速离心机（TG16-WS），生物显微镜（MoticBA210），恒温光照培养箱（MGC-800BP-2）。

1.2 野菊花水浸提液制备

使用天平称取5份20.00 g的野菊花，加到250 mL的锥形瓶中，然后分别向锥形瓶中加入125 mL蒸馏水，轻轻摇动，使所有野菊花花蕾浸入到蒸馏水中，制备成浓度为160.00 g/L的母液。设置的浸提时间分别为2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。室内自然水温（16℃）浸提到指定时间后，8000 r/min离心10 min后收集菊花母液，放入带盖玻璃管中，-20℃低温保存。

1.3 控藻实验

将处于指数增长期的藻种接种到新配置的无菌BG11培养液中，保证初始藻的光密度OD650为0.03（细胞密度7.81×105cells/mL），分别加入不同浸提时间的野菊花母液5 mL（实验体系中野菊花浓度8 g/L），对照组加入5 mL的灭菌纯水。为每个实验组设置3个平行。将处理后装有藻液的锥形瓶放在温度25℃，光照强度是2000lx并且光暗比12:12的培养箱中培养。每天手动摇动三次，培养3d后取样，将1 mL的样品用鲁哥氏液固定，显微镜下计数。

1.4 指标测定

使用浮游植物计数框（0.1 mL），在Motic BA210生物显微镜40倍下分别观察记录20个视野的细胞数，得到藻细胞密度（A），并根据以下公式计算铜绿微囊藻细胞日增长率（μ）和抑制率（IR）[15]：μ(/d)=ln(A3/A0)/3，IR(%)=100×(μC-μT)/μC，其中，A3和A0是每个样品实验结束（day3）和开始（day0）时的细胞密度，μC和μT分别为对照和处理中铜绿微囊藻细胞日增长率。

1.5 数据统计及分析

每个样品中的藻细胞密度数据以平均值±标准差显示。使用Microsoft Excel 2010，统计3d后的藻细胞密度，计算其日增长率，野菊花水浸提液的抑制率。用SPSS Statistics v22的单因素方差分析，分析不同浸提时间下得到的野菊花水浸提液对铜绿微囊藻的影响是否有显著性差异。

2 结果

2.1 铜绿微囊藻细胞数变化

为探讨野菊花水浸提液对铜绿微囊藻的影响，设置2 h、4 h、8 h、12 h和24 h的浸提时间浸提等量野菊花。暴露在不同浸提时间得到的野菊花水浸提液72 h后，经过处理的铜绿微囊藻细胞数都显著低于没有经过处理的组（p＜0.05）。并且铜绿微囊藻的细胞数随着浸提时间增加而减幅越大，通过单因素方差分析的结果可以看出，2 h与4 h间差异不显著但是与8 h、12 h、24 h有显著性差异（p＜0.05）。而且经过8h野菊花水浸提液处理的与12 h和24 h间没有显著性差异（p ＞0.05，图1）。

2.2 基于铜绿微囊藻细胞日增长率的抑制率

图1 不同浸提时间野菊花水浸提液对铜绿微囊藻细胞数的影响Fig.1 Effects of water extract of C.indicum cell concentrations of M.aeruginosa under different extraction time.Different letters indicate significant differences among treatments(p＜0.05)

不同浸提时间野菊花水浸提液对铜绿微囊藻细胞的抑制率，统计结果如表1。结果显示，2 h的浸提处理，藻细胞的比生长率最大，为0.16/d，12 h，24 h处理时，比生长率变成了负值，是-0.03/d，-0.05/d。浸提24 h有最高的抑制率为116.09%。

3 讨论

表1 野菊花水浸提液对铜绿微囊藻细胞增长的抑制率比较Table 1 Comparison of the growth inhibition rate of C.indicum water extracts on cell increase of M.aeruginosa

菊科是一种自然界里广泛分布的植物，并且菊科植物化学成分的多样性、复杂性远高于其他植物，其药用功效的研发和应用已有较大进展[16]，在园林景观等方面也有持久地发展[17]。前期已有研究发现菊科植物中有39个属存在明显的化感作用[18]。其中菊科植物中被明确鉴定出的能够对受体植物起到抑制或促进作用的化感物质常是有机酸类、酚类、萜类等[1 9]。但是，菊科植物对有害蓝藻影响方面的研究还较少，目前发现三种菊科植物[20-21]对铜绿微囊藻有一定的抑制效果。我们的前期调查发现野菊花也有较强的抑藻效果，但仍不清楚其有效抑藻活性成分或物质。本研究通过野菊花水浸提液抑藻实验，发现部分抑藻活性成分或物质应具有水溶性特征，这为我们下一步纯化活性组分和分离活性物质打下了基础。

浸提时间的选择影响到物质的溶出程度和浸提效率。沈洁采用24 h对柽柳花（Tamarix chinensis Lour）进行水浸提[22]。刘红云选择48 h对猫爪草（Ranunculi ternati）种子进行水浸提并研究其对三种植物的影响[23]。慕小倩等人选择72 h浸提得到10种菊科植物的水浸提液，研究其对小麦幼苗的化感作用[24]。但是不同浸提时间的比较研究却很少。本研究发现，对野菊花水浸提液最为有效的浸提时间为8h，远低于现有报道中所采用的水浸提液浸提时间，将显著提高浸提液制备效率，有助于后续对野菊花有效抑藻成分的纯化和活性物质的分离鉴定，也为其他植物源活性物质的研发提供了方法上的参考。