椎旁注射臭氧对SD大鼠盘源性疼痛模型的镇痛作用

吴志强，周利君，陈 嵩，李健齐，周志勇，庄文权

（中山大学1.附属第一医院放射介入科；

2.疼痛研究中心，广东广州510080）

经皮穿刺纤维化臭氧注射术治疗腰椎间盘突出症引起的疼痛是一种安全有效的治疗方法。然而Kang等［1］在总结大量临床实践发现，该方法并不能缓解患者椎间盘退变情况，反而可能加剧其退变。动物实验也发现，穿刺椎间盘的有创操作可加速其退变［2］。此后，一项多中心随机对照研究证实，在椎旁肌肉注射臭氧也同样能缓解腰椎间盘突出症患者的疼痛［3］。这或许可以减少对椎间盘的损伤从而缓解其退变。De Oliveira Magalhaes等［4-5］在多项荟萃分析认为椎旁注射臭氧减少了椎间盘的再次损伤，可达到镇痛作用，且并发症发生率下降，逐渐被临床医师接受。然而椎旁注射臭氧的镇痛规律，以及其对椎间盘退变的影响尚不明确。Murphy等［6］验证了臭氧可以减轻神经根受压达到镇痛作用，并认为抗炎作用是臭氧镇痛的另一机制但未得到证实。同时臭氧椎旁注射是否会加重椎间盘退变尚不明确。为了更好地指导今后的临床工作，本实验首先使用行为学方法研究臭氧椎旁注射对SD大鼠盘源性疼痛模型的镇痛规律，再通过磁共振扫描研究椎间盘退变的规律，最后通过western blot检测臭氧对坐骨神经和背根神经节中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和降钙素基因相关肽（calcitonin related gene peptide，CGRP）的影响，初步探讨其镇痛作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取鼠龄约7周的SPF级SD雄性大鼠65只，体质量220～250 g，由中山大学实验动物中心提供。实验动物生产和使用许可证分别为：SCXK（粤）2016-0029和SYXK（粤）2017-0081。饲养环境为恒温（22±2）℃，恒湿（55±5）%，每天照明12 h。大鼠入组条件：①双后肢50%机械撤足阈值（50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT）均高于10 g。②MR-T2WI成像各腰椎间盘Pfirrmann分级［7］均为I级，无先天性椎骨融合，无脊髓和坐骨神经受压表现。本动物实验经中山大学实验动物管理与使用委员会批准，并根据中山大学动物实验中心的实验动物操作标准进行。

1.2 实验试剂和仪器

VonFrey纤毛仪购自Stoelting公司，数字减影血管造影机（Allura Xper FD20）购自PHILIPS公司，磁共振扫描仪（Achieva 1.5T A-Series Nova Dual）购自PHILIPS公司，肿瘤坏死因子α一抗（ab8348）、降钙素基因相关肽一抗（ab47027）、βactin一抗（ab8226）购自Abcam公司。

1.3 动物分组

采用随机数表法分组，随机入选15只SD大鼠为对照组（50%MWT＞10 g）。另将成功建立的SD大鼠盘源性疼痛模型（50%MWT＜2 g）50只随机分为模型组（n=25）和臭氧组（n=25）。对照组不做任何处理，模型组经皮穿刺L5-6纤维环建立盘源性疼痛模型，臭氧组在造模成功后第22天椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL。三组大鼠均在造模前1天，造模后第1、3、7、14和21天，臭氧干预后第1、3、5、7、14、21、28和35天分别测量双后足50%MWT。臭氧干预后第8天取左侧坐骨神经和背根神经节，检测相关组织中TNF-α、CGRP的相对表达浓度。模型组在造模前1 d，造模后第14、21、28、35天行磁共振T2WI扫描。臭氧组在造模前1 d，造模后第14、21、35天及臭氧干预后第7、14天行磁共振T2WI扫描。

1.4 SD大鼠椎间盘源性疼痛模型的建立及臭氧干预处理

SD大鼠椎间盘源性疼痛模型的建立详细步骤见文献［2］。臭氧组的处理：在模型成功建立后22 d，将臭氧组SD大鼠用100 g/L水合氯醛（3.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，术野皮肤备皮后俯卧在硬纸板上并固定其四肢、消毒术野皮肤。在数字减影血管造影机透视引导下定位L5-6椎间盘，用27G注射针头从脊柱左侧旁处入路穿刺至L5-6椎间盘的椎旁近坐骨神经出口处，针与水平面夹角约45°。穿刺过程中注意大鼠左下肢是否颤动（若穿刺针刺激到坐骨神经，大鼠则会出现左下肢不自主颤动）。正侧位观察穿刺针位置和方向，针尖位置准确后，缓慢注射25 mg/L臭氧1 mL（图1）。注射完针头停留30 s后拔针。模型组造模成功后不做干预，对照组为正常SD大鼠。

图1 臭氧椎旁注射X线片正侧位及操作示意图Fig.1 X-ray and illustration of paravertebral ozone injection

1.5 SD大鼠行为学观察

造模前1 d，造模后第1、3、7、14、21天以及臭氧干预后第1、3、5、7、14、21、28和35天将各组大鼠放置于有机玻璃箱内，观察大鼠有无易激惹、撕咬肢体、运动功能障碍以及有无大小便失禁等情况。

1.6 SD大鼠50%MWT的测定

造模前1 d，造模后第1、3、7、14、21天以及臭氧干预后第1、3、5、7、14、21、28和35天将各组大鼠放置于有机玻璃箱内，参考Garraway的“Up-Down”方法［8］测定50%MWT。

1.7 磁共振T2WI序列检查

磁共振检查建模前后及臭氧干预前后椎间盘退变情况：模型组大鼠随机取20只在建模前1 d，建模后第14、21、28、35天分别行腰椎间盘磁共振T2WI序列检查。臭氧组大鼠随机取20只在建模前1 d，建模后第14、21天，臭氧干预后第7、14天分别行腰椎间盘磁共振T2WI序列检查。观察大鼠L4-5，L5-6，L6-7椎间盘退变情况。由磁共振室2名教授采用Pfirrmann分级法进行盲法分级［7］。

1.8 肿瘤坏死因子α、降钙素基因相关肽的检测

臭氧干预后第7天，对照组、模型组和臭氧组各取5只大鼠，麻醉，在冰面上取材，取左侧坐骨神经（出髂骨段至分出腓总神经以上部分）、左侧L4-6背根神经节，标本取出后立即放液氮中极速冷冻。按照Wu等［2］的Western blot方法测定组织中的肿瘤坏死因子α和降钙素基因相关肽。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。50%MWT结果采用重复测量方差分析，方差不齐时，使用Greenhouse-Geisser方法进行校正。若存在交互效应，进一步采用多元方差分析方法检验组别和时间的单独效应，差异有统计学意义时均采用Bonferroni法进行两两比较。L5-6椎间盘Pfirrmann分级采用卡方检验分析。Western blot结果采用单因素方差分析，差异有统计学意义时均采用Bonferroni法进行两两比较。双侧检验，以α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 SD大鼠一般行为学检测结果

成模及臭氧干预后，所有SD大鼠均未出现易激惹、撕咬肢体、运动功能障碍以及尿便失禁等情况。

2.2 SD大鼠50%MWT检测结果及疗效分析

造模前3组50%MWT差异无统计学意义（左n=50，F=0.037，P=0.964；右n=50，F=1.11，P=0.338）。造模后第1天，模型组和臭氧组50%MWT均有下降，模型组或臭氧组与对照组比较差异均有统计学意义（P均＜0.001）；而模型组与臭氧组间差异无统计学意义（左P=0.258，右P=0.832）；造模后第3～21天，对照组与模型组或臭氧组之间差异均有统计学意义（P均＜0.001）。而模型组与臭氧组间差异无统计学意义（左P=0.583，右P=0.343）。造模后第22天给予25 mg/L臭氧干预。造模后第22天，3组50%MWT两两比较差异均有统计学意义（P均＜0.001）。在臭氧干预前后各时间点，模型组组内50%MWT无统计学差异（左P=0.985，右P=0.973）。臭氧组50%MWT从造模后第22天开始上升（左后足7.6±6.8，右后足3.6±1.0），至造模后第24天达到最高峰（左后足10.6±8.2，右后足7.9±6.7），以后维持这一水平至造模后第56天（图2）。

图2 三组SD大鼠的双后足50%MWT的变化曲线Fig.2 Curve of 50%mechanical withdrawal threshold of both hind paws in three groups

模型组和臭氧组SD大鼠在造模后双后足50%MWT均低于2.0 g。臭氧组SD大鼠共20只，50%（10/20）大鼠左后足疼痛在造模后第22天开始缓解（50%MWT＞4.0 g）；大鼠左后足疼痛在造模后第28天的缓解率为90%（50%MWT＞ 4.0 g），其中40%大鼠疼痛基本缓解（50%MWT＞10.0 g）。40%大鼠右后足疼痛在造模后第22天开始缓解（50%MWT＞4.0 g），大鼠右后足疼痛在造模后第28天的缓解率为70%（50%MWT＞4.0 g），其中20%的大鼠右后足疼痛基本缓解（50%MWT＞10.0 g）。模型组的SD大鼠在随访期间双后足50%MWT没有改善。

2.3 模型组和臭氧组大鼠腰椎间盘磁共振T2WI序列扫描结果

模型组大鼠建模后各时间点L5-6椎间盘Pfirrmann分级有统计学差异，随时间延长而Pfirrmann分级更高（n=40，H=13.88，P ＜ 0.001）。臭氧组大鼠在臭氧干预后Pfirrmann分级高于模型组大鼠（n=40，H=9.38，P ＜ 0.001；图3，表1）。

图3 模型组和臭氧组大鼠腰椎间盘磁共振T2WI成像信号变化Fig.3 Sagittal MR T2weighted images of rat intervertebral disk before and after modeling and ozone injection

表1 模型组和臭氧组大鼠腰椎间盘磁共振Pffirmann分级Table 1 Pffirmann grade of L5-6 intervertebral disk in model group and ozone group

2.4 肿瘤坏死因子α和降钙素相关基因肽表达结果

3组SD大鼠，左侧坐骨神经中肿瘤坏死因子α（n=15，F=13.28，P ＜ 0.001）和降钙素基因相关肽（n=15，F=9.32，P ＜ 0.001）在3组表达差异有统计学意义。两两比较发现模型组的表达均高于臭氧组，臭氧组又高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.001；图4）。

图4 三组SD大鼠左侧坐骨神经中肿瘤坏死因子-α和降钙素基因相关肽的表达情况Fig.4 Expression of calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor-α in sciatic nerve in three groups

2.5 三组SD大鼠左侧背根神经节中肿瘤坏死因子和降钙素相关基因肽的表达结果

左侧背根神经节中肿瘤坏死因子α（n=15，F=11.98，P＜0.001）和降钙素基因相关肽（n=15，F=12.86，P＜0.001）在3组表达差异有统计学意义。两两比较发现模型组的表达均高于臭氧组，臭氧组又高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.001；图5）。

图5 三组SD大鼠左侧背根神经节中肿瘤坏死因子-α和降钙素基因相关肽的表达Fig.5 Expression of calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor-α in dorsal root ganglion in three groups

3 讨论

背根神经节不仅参与了痛觉的传导和调节的外周机制，同时作为感觉传入的初级神经中枢，具有合成和分泌功能［9］。Krames等［10］发现，纤维环损坏时所释放的物质可刺激背根神经节开发离子通道，通过坐骨神经传导，引起下肢痛觉敏感。背根神经损伤所致的痛觉过敏、痛觉异常和自发的持续性疼痛都是由初级传入神经元的变化所引起。这些症状至少部分反映了初级传入神经元电活性和/或表型的变化。尤其是初级传入神经元异位电活动，不仅是持续的临床神经病理性疼痛症状的点火者，同时还参加了痛觉过敏和痛觉异常密切相关的中枢敏化［11］。

Niu等［12］研究发现，臭氧浓度的选择与疗效密切相关，过低浓度可能因氧化作用弱使疗效欠佳，而过高浓度则容易引起组织损伤。临床上治疗腰椎间盘突出症的浓度为25～50 mg/L，注射剂量在5～15 mL。本研究在前期预实验中也发现25 mg/L浓度的臭氧1 mL椎旁注射对SD大鼠盘源性疼痛模型已有较好的镇痛作用，而更大剂量（2 mL）容易导致实验动物死亡。根据术中X线透视下所见及动物尸体解剖发现：部分大鼠在臭氧注射时有明显沿椎管上行至脑部的气流，数秒后实验动物即出现呼吸骤停，解剖未发现大鼠脊髓损伤。实验动物的死亡原因考虑与臭氧通过椎管扩散至高级神经中枢，抑制呼吸中枢有关。本实验最后选择浓度25 mg/L臭氧1 mL椎旁注射作为研究干预条件。

本研究通过检测SD大鼠盘源性疼痛模型的臭氧干预前后的双后足50%MWT的变化，初步结果显示大鼠盘源性疼痛模型椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL后，90%的大鼠左后足50%MWT明显升高（由1.31±0.52提高至4.24±1.96），显示有镇痛效果，有40%的大鼠疼痛症状基本消失，由此可以推断椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL对大鼠盘源性疼痛模型有一定的镇痛作用。

本研究对比了模型组大鼠与臭氧组大鼠椎间盘T2WI表现，发现臭氧椎旁注射虽能缓解椎间盘退变引起的疼痛，但却加速了椎间盘的退变，是一种破坏性的治疗方式，故在临床实践中，对于盘源性疼痛的早期患者，可以通过一些非干预性的治疗缓解症状，而臭氧椎旁注射并不是一种首选方法。

正常情况下肿瘤坏死因子α在中枢神经系统与外周神经系统中的表达很低，分布亦较局限。脊髓损伤时，肿瘤坏死因子α的表达上调，主要分布于神经元及神经胶质细胞［13］。Shubayev等［14］将示踪的肿瘤坏死因子α注射到大鼠的坐骨神经损伤部位后，发现肿瘤坏死因子α可以由轴突逆行转运至脊神经节；又在大鼠的L5神经节注射生物素化的肿瘤坏死因子α，应用抗生物素化的方法测定其移动的位置，发现肿瘤坏死因子α可以传导至正常和受伤的大鼠外周神经，也可以传至损伤侧的脊髓后角。他们认为外周神经损伤后肿瘤坏死因子α逆行传至中枢，可能参与了中枢部位的细胞因子的激活，是神经源性疼痛发病机制原因之一。在本实验研究中我们发现，臭氧干预后SD大鼠坐骨神经和背根神经节的肿瘤坏死因子α有明显下降，但并未降至造模前水平，而大鼠左后足50%MWT也同时表现为较治疗前明显升高而未完全达到造模前水平。臭氧组50%MWT显著高于模型组。这与Murphy等［6］研究结果类似。可能原因是臭氧治疗可以缓解但不能完全阻止大鼠盘源性疼痛的炎症性反应。当再次出现外界刺激时，炎症细胞可能再次被激活，并释放炎症因子引起疼痛复发。在临床上我们也发现，部分患者在臭氧治疗一段时间后可出现疼痛症状复发，再次接受臭氧治疗后疼痛症状仍可缓解或消失。

越来越多的证据表明，降钙素基因相关肽在外周致敏和相关的增强疼痛的发展中起关键作用。降钙素基因相关肽参与神经源性炎症的发展，并且在炎症和神经病理性疼痛发生时上调［15］。降钙素基因相关肽主要介导伤害性感受传递，并在外周敏化和中枢敏化中均起到重要作用［16］。De Logu等［17］发现：大量的兴奋性离子通道和受体可以诱导降钙素基因相关肽的释放，从而诱发疼痛。另有学者发现，降钙素基因相关肽抑制剂可有效缓解盘源性疼痛动物模型的疼痛［18］。在本实验研究中，我们发现臭氧干预后，臭氧干预组的大鼠坐骨神经和背根神经节的降钙素基因相关肽表达较模型组的明显下降。推测臭氧可能通过某种途径抑制降钙素基因相关肽的表达，降低疼痛敏感度，起到镇痛作用。

综上所述，臭氧椎旁注射可以缓解盘源性疼痛模型大鼠的疼痛，但却加重了其腰椎间盘的退变。臭氧椎旁注射可降低模型大鼠坐骨神经及背根神经节中肿瘤坏死因子-α和降钙素基因相关肽的表达，可能通过抗炎作用、减少疼痛信号传导达到镇痛的效果。