γ-聚谷氨酸对小麦淀粉凝胶冻融稳定性的影响

谢新华，范逸超，徐超，沈玥，张蓓，邢彩云

(河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州，450002)

近年来速冻面米制品的生产与发展迅速，汤圆、水饺、馒头、速冻米饭等产品都有了一定规模的工业化生产。速冻食品在运输、储存、销售的过程中多次的冻融会导致食品品质的劣变，例如口感变差、失水变硬、蒸煮后表皮破裂、失去弹性[1]。通过改变冻结方式、添加多糖、亲水胶体、抗冻蛋白、淀粉酶等可以提高淀粉及其制品的冻融稳定性。MUADKLAY等[2]研究发现淀粉凝胶的冻融稳定性受亲水胶体的添加和冷冻速率的影响，黄原胶对木薯淀粉的作用比刺槐豆胶、魔芋葡甘聚糖、瓜尔豆胶好，冷冻速率2.3 ℃/min最佳；YAMAZAKI等[3]研究发现黄麻叶多糖降低了玉米淀粉凝胶的析水率，改善了淀粉凝胶的微观结构和流变学特性。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是D型谷氨酸或/和L型谷氨酸通过γ-羧基和α-氨基形成的线性高分子阴离子聚合物[4]，由酰胺键连接，链之间可形成大量氢键，使其具有很好的水溶性、吸水性、保水性、抗冻活性[5]，γ-PGA可生物降解为谷氨酸，对人体安全无毒，能广泛用于食品中。SHIH等[6]研究发现γ-PGA的抗冻活性随其相对分子质量的降低而增加，其盐类的抗冻能力Mg2+>Ca2+>Na+>K+；JIA等[7]研究发现γ-PGA添加量(质量分数)为0.5%、1%、3%的冷冻甜面团储存8周后，制成的面包体积分别增加了6.3%、8.9%、3.3%，γ-PGA增强了冷冻面团的抗冻性；宋佳薇等[8]研究发现低分子质量γ-PGA对冷冻面团和面条的可冻结水含量、储存模量、损耗模量和硬度影响较明显，具有更强的抗冻保护作用。本文通过差式扫描量热仪(differential scaning calorimeter,DSC)、低场核磁共振仪(nuclear magnetic resonamce,NMR)、X-射线衍射仪(X-ray diffractometry)、扫描电镜(scanning dectron microscopy,SEM)来测定γ-PGA对小麦淀粉冻融稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦淀粉，封丘雪菊华丰粉业有限公司；γ-PGA，西安四季生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

RVA 4500 型快速黏度分析仪，瑞典波通仪器公司；DSC 214 型差式扫描量热仪，德国耐驰Netzsch公司；Micro MR型低场核磁共振仪，上海纽迈电子科技有限公司；ME 104E/02精密电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司/上海；FD 1005 型真空冷冻干燥机，上海今友试验设备有限公司；X'Pert PRO X-射线衍射仪，荷兰PANalytical公司；QUANTA FEG 250场发射扫描电镜，美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

用快速黏度仪制备质量分数为6%(以淀粉干基计)的小麦淀粉糊，γ-PGA添加量(质量分数)分别为小麦淀粉的0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%。采用GBT 24853—2010的标准方法进行糊化[9]。淀粉凝胶在-18 ℃ 储存22 h，25 ℃解冻2 h，作为一个冻融循环。

1.3.2 抗冻活性的测定

配制质量分数为0.7%的γ-PGA溶液，称取10 μL于DSC坩埚中平衡2 h，蒸馏水为对照，空坩埚作参比，氮气为载气。测试参数：降温至-30 ℃，并在该温度下保持5 min，以5 ℃/min的速率升温至30 ℃[10]。每个样品3个平行，记录冻结水的融化焓(△Hw)及冻结溶液的融化焓(△Hγ)。

抗冻活性(AF)计算公式如式(1)[11]：

(1)

式中：△Hw，冻结水的融化焓，mJ/mg；△Hγ，冻结溶液的融化焓，mJ/mg；C，溶液中抗冻剂含量，%(质量分数)。

1.3.3 老化焓值的测定

配制质量分数为30%(以淀粉干基计)的小麦淀粉悬浮液，γ-PGA添加量(质量分数)分别为小麦淀粉的0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，称取10 μL样品于DSC坩埚中，室温下平衡24 h，空坩埚作参比，氮气为载气。测试参数：20～100 ℃，以10 ℃/min的速率升温。经过1、3、5、7次冻融循环后的样品，在20～120 ℃以相同速率再次进行测定，每个样品3个平行。并按照公式(2)计算淀粉凝胶老化率[12]：

(2)

式中：△Hr，老化焓，J/g；△Hg，糊化焓，J/g。

1.3.4 水分状态测定

将1.3.1糊化后的样品称取0.5 g，进行1、3、5、7次冻融循环，解冻后用保鲜膜包裹放入核磁管中，置于永久磁场中心位置的射频线圈中心，进行CPMG序列测定，每个样品3个平行。序列参数：磁体温度32 ℃，90°脉冲宽度17 μs，180°脉冲宽度33 μs，模拟增益RG1为20，数字增益DRG1为3，采样频率SW为200 KHz，重复采样间隔时间TW为3 000 ms，累加采样次数NS为32，采样点数TD为249 014，回波个数NECH为5 000[13]。测试结束后进行数据反演。

1.3.5 晶体结构测定

将1.3.1制备的样品，7次冻融循环后，在-40 ℃ 预冷冻48 h，真空冷冻干燥，将冻干的样品粉碎，过200目筛，取少量样品进行测定。另外，测定原小麦淀粉的晶体结构。测试参数：管压40 kV，管流30 mA， 扫描方式为连续，扫描范围5～40°(2θ)，扫描速度2°/min。用MDI Jade 6.0软件分析衍射图谱，按照公式(3)计算相对结晶度[14]。

(3)

式中：Xc，相对结晶度，%；Ac，结晶区面积；Aa，非结晶区面积。

1.3.6 微观结构观察

将1.3.1制备的样品，7次冻融循环后，在-40 ℃预冷冻48 h，真空冷冻干燥。掰取一小部分样品，固定在双面导电胶上，喷金30 s后，扫描观察其微观结构。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，采用Origin 2017软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 γ-PGA的抗冻活性

由图1可知，γ-PGA冻结液融化起始温度为-1 ℃，蒸馏水冻结液为-0.5 ℃，峰值温度比蒸馏水低，γ-PGA 冻结液融化焓为323.2 J/g，蒸馏水冻结液为341.7 J/g，融化焓显著降低。由公式(1)计算得γ-PGA抗冻活性(AF)为6.17，抗冻活性明显，可能是因为γ-PGA的亲水基团与水分子形成氢键，阻止部分水分子形成冰晶，明显抑制了水分子在冻结时结晶，降低冻结液的融化焓[15]。

图1 冻结水和冻结γ-PGA的DSC曲线Fig.1 The DSC curve of frozen water and frozen γ-PGA

2.2 γ-PGA对小麦淀粉老化焓值及老化率的影响

由表1、图2可知，经过1、3、5、7次冻融循环后，小麦淀粉凝胶的老化焓、老化率随冻融次数的增加而增加，添加γ-PGA后老化焓值、老化率均降低，且随添加量增加而降低更明显，说明γ-PGA延缓了小麦淀粉的老化，添加量为0.7%时效果最佳。在老化焓的测定中出现了两个峰，峰Ⅰ在45～60 ℃，为支链淀粉分子重结晶的熔融峰[16]；峰Ⅱ在100～115 ℃，为γ-PGA- 淀粉体系的熔融峰[17]。γ-PGA分子链上的羟基与淀粉分子结合，阻碍淀粉分子通过氢键缔合，减少直链淀粉渗出[18]，可以抑制淀粉的重结晶，延缓淀粉凝胶的老化，增加小麦淀粉的冻融稳定性。

表1 γ-PGA对不同冻融次数小麦淀粉凝胶老化焓的影响 单位：J/g

注：同列数值上标的字母不相同表示存在显著性差异(P<0.05)，相同表示不存在显著性差异(P>0.05)，下同。

图2 γ-PGA-小麦淀粉老化率Fig.2 The aging rate of γ-PGA-wheat starch

2.3 γ-PGA对小麦淀粉凝胶水分迁移的影响

由图3可知，冻融后的小麦淀粉水分子横向弛豫时间图谱中有3个峰，表明水分子有3种存在方式，其中T21为深结合水，T22为弱结合水，T23为自由水，添加γ-PGA后T21、T22、T23的弛豫时间基本都变短，水分结合紧密，不易迁移[19]。由表2、表3可知，未经过冻融的小麦淀粉凝胶，添加γ-PGA后深结合水比例先增加后降低，弱结合水比例降低。冻融循环次数逐渐增加，小麦淀粉凝胶的深结合水比例降低，弱结合水比例增加，水分子迁移使淀粉分子聚集，形成淀粉晶核，导致淀粉分子重结晶[20]；添加γ-PGA后，深结合水比例随添加量的增加而增加，弱结合水比例随添加量的增加而降低，抑制深结合水向弱结合水转化[21]，添加量为0.7%时效果最好。γ-PGA的亲水性羧基通过氢键与淀粉分子交联，增加深层结合水相对含量，减少冰晶的形成[22]，增加小麦淀粉凝胶的冻融稳定性。

图3 7次冻融循环水分子横向弛豫时间Fig.3 The lateral relaxation time of water molecules after 7 freeze-thaw cycles

表2 冻融过程深结合水比例变化 单位：%

表3 冻融过程弱结合水比例变化 单位：%

2.4 γ-PGA对小麦淀粉凝胶晶体结构的影响

由图4可知，经过7次冻融循环的小麦淀粉在2θ为17°、20°附近时出现2个结晶峰，为B型和V型结晶[23]，B型结晶主要是淀粉凝胶老化造成的，V型结晶是γ-PGA与小麦淀粉复合物老化造成的[24]，17°出现的结晶峰说明直链淀粉出现重结晶。相对结晶度随γ-PGA添加量的增加而降低，添加γ-PGA添加量为0.7%时降低了3.55%，效果明显。这是因为γ-PGA 与淀粉分子形成氢键，阻碍了淀粉分子间氢键的形成，抑制了小麦淀粉的重结晶[25]，增加了冻融稳定性。

图4 7次冻融循环的X-射线衍射图谱Fig.4 The X-ray diffraction pattern after 7 freeze-thaw cycles

2.5 γ-PGA对小麦淀粉凝胶微观结构的影响

由图5观察到，经过7次冻融循环后淀粉凝胶的孔洞变大、不均匀、淀粉基质变的疏松，主要是热能波动、水分迁移、结冰膨胀压和渗透压破坏了淀粉凝胶内部结构[26]，添加γ-PGA后小麦淀粉凝胶孔洞逐渐变小、变均匀、更紧密，当添加量为0.7%时效果明显。这是因为γ-PGA黏度较大，在水溶液中产生的渗透压阻止淀粉颗粒充分溶胀，使淀粉相体积减少[27]，与淀粉体系形成连续相，具有更紧密的结构[28]，γ-PGA阻碍了直链淀粉分子重排，提高了小麦淀粉糊的冻融稳定性。

图5 7次冻融后的小麦淀粉凝胶微观结构Fig.5 The wheat starch gel microstructure after 7 freeze-thaw cycles

3 结论

γ-PGA可以显著降低小麦淀粉的老化焓值、老化率，延缓淀粉老化。γ-PGA使小麦淀粉凝胶的深结合水比例增加，弱结合水比例降低，水分结合紧密，减少了水分迁移与冰晶的形成。γ-PGA降低了小麦淀粉凝胶的结晶度，抑制了直链淀粉、支链淀粉的重结晶，控制了冻融循环导致淀粉凝胶的重结晶现象。添加γ-PGA明显改善了淀粉凝胶的微观结构，使其孔洞变小、更均匀、更紧密，缓解了冻融循环对其内部结构的破坏。γ-PGA明显提高了小麦淀粉凝胶的冻融稳定性，且随添加量的增加，效果越明显，添加量(质量分数)为0.7%时，γ-PGA的作用最大。这与JIA等和宋佳薇等[7-8]的研究有类似的结果，他们的研究表明γ-PGA对冷冻面团有很好的抗冻保护作用，而面团的主要成分为淀粉和蛋白质，目前很少有关于γ-PGA对淀粉和蛋白质冻融特性的影响进行详细的研究，本文则对淀粉制品抗冻保护方面提供了理论依据。