猪丹毒丝菌的分离鉴定与药敏分析

祭冬琴，王 旭

（盐城光明生猪有限公司，江苏 盐城 224151）

猪丹毒是由猪丹毒丝菌（E.rhusiopathiae）引起的一种人畜共患传染病，猪感染后死亡率较高，对生猪养殖造成重大损失。该病流行于世界各地[1]，在夏季高发，发病猪背、颈、耳后等部位出现紫红色斑块；病猪呼吸急促，体温升高；有时会出现关节肿胀、瘫痪、无法站立等临床症状。解剖死猪，可见腹股沟淋巴结肿大出血，十二指肠及空肠前段出血，大肠浆膜有灰白色坏死灶，肺充血，胸腔内有淡黄色积水[2]。

由于生物学鉴定耗时长，步骤繁琐，不太适合养殖生产中使用，因此，借鉴相关研究，将分子生物学方法引进养殖生产中使用，可以快速诊断病原，及早治疗。对猪丹毒丝菌进行药敏分析，筛选最佳治疗药物，为当地生猪养殖过程中猪丹毒的防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发病猪于2018年6月取自盐城市大丰区某标准化生猪养殖场，体重30 kg左右，刚开始猪食欲不振，没有精神，体温40.2℃，耳根处出现少许紫色斑块，初步诊断为猪丹毒。试验用药敏纸片采购自杭州微生物试剂有限公司；PCRMix、溴化乙锭（EB）、Marker 2 000采购自北京艾德莱生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒采购自北京天根生化科技有限公司；用于扩增猪丹毒丝菌的引物由上海生工合成；血琼脂平板采购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌的分离

在超净工作台中，将病死猪的肝脏表面用酒精棉消毒，用灭菌后的接种环刮取后接种于血平板，37℃培养24 h。挑选优势菌落接种于斜面培养基，37℃培养24 h，4℃冰箱保存备用。

1.3 病原菌的鉴定

按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取分离到的致病菌DNA，使用猪丹毒丝菌16S rDNA引物[3]扩增致病菌DNA，以猪丹毒丝菌DNA为阳性对照，以ddH2O为阴性对照。正向引物F：TGACATACCGCG CAAAAGCA、逆向引物R：GGCTCCCTCCTAGTAAAC TA，目的片段长度为472 bp，扩增条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增后，用添加EB的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压120 V、电泳15 min。电泳后使用紫外分析仪观察结果。

1.4 猪丹毒丝菌药敏分析

采用纸片琼脂扩散法（K-B法），在超净工作台中，将分离到的致病菌用生理盐水制备成浓度约107～108cfu/mL细菌悬浊液，然后取100 μL涂布于血平板，等待15 min，将不同的药敏纸片均匀地贴在血平板上，37℃培养24 h后，观察结果，量取抑菌圈直径，确定致病菌对各药物的敏感性。

2 结果

2.1 发病情况

发病猪场位于江苏大丰，为标准化生猪养殖场，有完善的排水通风设备，存栏生猪2 600头。2018年6月初发现个别猪精神萎靡，无食欲，体温达40.2℃，2 d后发现耳后出现红色色斑，3 d后死亡，随着时间推移，病情有扩散迹象。

2.2 致病菌的分离鉴定

从患病猪的肝上分离到致病菌，其在血平板上培养24 h后出现半透明、边缘整齐、针尖大小的圆形菌落，菌落周围有轻微溶血。致病菌的PCR电泳图谱见图1，由图1可以看出，致病菌使用猪丹毒丝菌特异性引物作PCR，在450 bp位置出现亮带，与阳性对照位置相同，阴性对照未出现条带，说明分离的致病菌是猪丹毒丝菌。

图1 致病菌的PCR电泳图谱

2.3 致病菌的药敏分析

使用畜牧养殖中常用的恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林等抗生素对分离的致病菌进行药敏试验，药敏试验结果见表1。结果表明，分离的猪丹毒丝菌对恩诺沙星、氟苯尼考和庆大霉素等敏感，对万古霉素、卡那霉素等耐药。

表1 各抗生素药敏结果

3 讨论

猪丹毒丝菌在自然界广泛分布，可寄生于哺乳动物、鸟类、两栖类等，其中猪对该菌最为敏感[4]。猪丹毒丝菌引起的猪丹毒是一种急性的人畜共患病，可以引起猪急性的败血症和慢性的关节炎，以及心内膜炎，对其他畜牧养殖品种也存在一定的危害。猪丹毒流行于世界各国家及地区，也是我国主要的猪传染病之一，对生猪养殖业造成严重的经济损失。

猪丹毒丝菌随发病猪的排泄物排出，污染猪棚、饮水，该菌也可以通过损伤皮肤及蚊虫叮咬传播。猪丹毒以急性型最常见，该病突然暴发，发病时间短，死亡率高，因此，提早发现和确认病原是防控猪丹毒的关键。传统的生物学鉴定耗时长，步骤繁琐，且具有一定的主观性，一般需要2～3 d才可完成，延误了疾病的治疗[5]。本文采用分子生物学方法检测猪丹毒丝菌，从采样到确认病原仅需几个小时，大幅提高了检测效率，可以及时确认病原，对症下药。

董建斐等（2018）对从浙江宁波某养殖场分离的猪丹毒丝菌进行药敏试验，结果发现该猪丹毒丝菌对阿莫西林、恩诺沙星等敏感，对庆大霉素、卡那霉素等耐药[6]。这与本文结果有所差异，可能是因为各地区养殖环境、养殖习惯和用药习惯不同，造成不同地区猪丹毒丝菌对抗生素的敏感性不同。

按照本次药敏试验的结果，选择恩诺沙星作为治疗药物。由于发病猪精神萎靡，食欲不佳，我们先将发病猪隔离，然后采用肌肉注射恩诺沙星，每天注射1次，同时监测体温，直到体温下降、食欲恢复后停止注射；对未发病的猪拌服恩诺沙星，连续投喂，直到场中不再有新发病猪；加强猪场消毒，每天消毒两次。采取以上措施进行防控后，该猪场猪丹毒疫情得到有效控制，15 d后该猪场未发生死猪的情况。