膀胱癌尿液差异蛋白鉴定及生物信息分析

雷 婷，张 曼

（首都医科大学附属北京世纪坛医院医学检验科 北京大学第九临床医学院医学检验科尿液细胞分子诊断北京市重点实验室，北京100038）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中，膀胱癌的发病率和病死率均居首位，严重威胁着人们的健康，所以膀胱癌始终是恶性肿瘤研究中的一个焦点。在我们的前期研究中，利用有机溶剂萃取蛋白［1］及超速离心的方法分别提取了正常人和膀胱癌患者的尿蛋白，成功建立了正常人和膀胱癌的尿蛋白差异双向凝胶电泳图［2-3］，利用图像分析软件及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF/TOF-MS）对30个差异蛋白点进行分析，共鉴定出14个差异蛋白，本文将对这14个差异蛋白通过软件进行结构、功能、通路的生物信息学分析，为膀胱癌的进一步深入研究提供理论基础。

材料和方法

1 资料

研究对象为利用双向凝胶电泳结合MALDITOF-MS鉴定出膀胱癌与正常对照的14个尿液差异蛋白：β2微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2-MG）；脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein，adipocyte，A-FBAP）；凝溶胶蛋白（gelsolin，GSN）；凝溶胶蛋白亚型1（isoform 1 of GSN）；肌红蛋白（myoglobin，MYO）；纤维蛋白原α链（isoform 2 of fibrinogen alpha chain，α-FGA）；载 脂 蛋 白 A-I（apolipoprotein A-I，Apo A-I）；前列腺素合成酶（prostaglandin D2 synthase 21kDa（brain），LPGDS）；AMBP蛋白（Protein AMBP）；转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）；角蛋白1（keratin，cytoskeletal 1）；角蛋白8（keratin，cytoskeletal8，CK-8）；推测蛋白白蛋白（putative uncharacterized protein ALB）；推测蛋白甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2（putative uncharacterized protein MASP2（Fragment））。

2 分析方法

2.1 将双向电泳分离、凝胶图像筛选的30个差异蛋白点，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）技术得到30个肽质量指纹图谱（PMF），再对每个图谱中的前五位相对丰度高的肽段进行串联质谱分析得到相应的氨基酸序列。以Mascot蛋白数据库为搜索引擎，在swissprot数据库搜索，进行蛋白质鉴定分析。

查询条件：肽指纹图中的肽片段质量控制在700～4000。肽片段分子量最大容许误差控制在±0.1Da。酶解片段不完全选择为1个，离子选择［M+H］和AVERAGE。最少匹配肽片段规定为5。Homo Sapiens默认，mass tolerance 0.2Da，MS/MS tolerance 0.6Da。

2.2 应用ProtParam：http：//www.expasy.org/tools/对鉴定出的蛋白质进行理化等基本性质分析。

2.3 应用Uniprot：http：//www.uniprot.org/对鉴定的蛋白质进行生物功能信息分析。

2.4 应用Gene Ontology：http：//www.geneontology.org/在蛋白和基因水平进行综合分析，主要涵盖生物学的三大分类：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物过程（biological process，BP）。

2.5 应用KEGG：http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html得到关于膀胱癌相关分子相互作用和反应网络的通路图。将我们鉴定出的差异蛋白结合KEGG通路图，分析其作用途径。

结 果

1 膀胱癌与正常对照尿液差异蛋白基本信息分析

对前期研究中选出的30个差异点通过Mascot蛋白数据库为搜索引擎，在swiss-prot数据库搜索，鉴定出22个蛋白质，其余8个蛋白斑点由于搜索数据库未能得到可信度较高的结果而未能鉴定。对22个蛋白质合并去重后共得到14个蛋白质，其中2个为推测蛋白，结合ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/）和Uniprot（http：//www.uniprot.org/）对12个蛋白质的基本信息进行分析，见表1。

表1 膀胱癌与正常对照尿液差异蛋白基本信息

2 利用GO、GOSlim 和GeneCoDis进一步对鉴定蛋白在基因水平进行分析

通过Uniprot对鉴定的14个蛋白质的基因水平进行分析，发现14个蛋白对应13个基因，分别为：

B2M、FABP4、GSN、MB、FGA、APOA1、PTGDS、AMBP、TTR、KRT1、KRT8、MASP2、ALB（Gelsolin和Isoform 1 of Gelsolin对应的基因均为GSN）。通过GO得到14个蛋白的注解，利用GOSlim得到注解的摘要后应用GeneCoDis3.0分析软件［4］（http：//genecodis.cnb.csic.es/）分别从分子功能（GOSlim Molecular Function）、生物进程（GOSlim Biological Process）和整体（Co-occurrence）进行分析。该软件默认当P＜0.05时，含有共同注解的基因产物存在着明显的关联，可从理论基础上进一步分析相关的生物学机制。

从分子功能方面对14个鉴定蛋白的基因分析结果见表2，可见13个基因中KRT8、KRT1、FGA、APOA1、FABP4、ALB、GSN、B2M、MASP2、TTR10个基因均具有蛋白结合的分子功能；PTGDS、ALB、TTR3个基因均具有转运蛋白活性的分子功能；ALB、MB2个基因具有氧结合功能，ALB还具有抗氧化活性。

表2 差异蛋白的基因在分子功能方面的分析

将表2内容从基因名称和GO注解以图形表示，见图1。

图1 利用GeneCoDis对鉴定14种差异蛋白的基因关系从分子功能方面的分析图

从参与生物进程方面对14个鉴定蛋白的基因分析结果见表3，可见13个基因中MB、ALB、AMBP、PTGDS、TTR、FABP4 6个基因参与转运过程；KRT8参与细胞骨架合成。

表3 差异蛋白的基因在分子功能方面的分析

从整体水平对14个鉴定蛋白的基因分析结果见表4，可见13个基因中KRT8、KRT1、FGA、APOA1、FABP4、ALB、GSN、B2M、MASP2、TTR10个基因均具有蛋白结合的分子功能；AMBP、FABP4、PTGDS、ALB、MB、TTR6个基因均参与了转运的生物进程；FABP4、ALB、TTR3个基因既具有蛋白结合的分子功能又参与了转运的生物进程；AMBP、FABP4、PTGDS既具有转运蛋白活性又参与了转运的生物进程。

表4 差异蛋白的基因整体水平分析

将表4内容从基因名称和GO注解以图形表示，见图2。

3 利用KEGG分子差异蛋白与膀胱癌通路的关系

通过KEGG分析膀胱癌相关分子相互作用和反应网络的通路图，见图3。其中主要包括6条分子途径：MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Cell cycle、p53 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Adherens junction，每条途径又包含了若干子途径。其中APOA1参与了子途径PPAR信号通路，见图4。

图3 膀胱癌相关分子相互作用通路图

图4 PPAR信号通路

讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中，膀胱癌的发病率和病死率均居首位，传统诊断和随访方法是膀胱镜检及尿细胞学检查，前者为诊断膀胱癌的金标准，但为有创检查、费用相对昂贵、技术要求高，后者虽属无创特异性高，但灵敏度低，仅35%，限制了在临床的应用。尿液作为人体代谢的终产物之一，具有大量留取性、无创性、大规模重复取样性、保存方便等独特的优势。与血液相比，尿蛋白构成相对简单、易于分析，在通过体液诊断疾病方面具有很大优势。尿液的组成、数量与性状的变化不仅携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息，也反映了机体的整体代谢状态，为研究脏器功能、评价机体状态、代谢情况、动态监测疾病进展和判断疗效等方面提供了各种信息［5-7］。因此它是诊断和判断疾病分级进展的理想物质，值得我们对其进行进一步的探索与研究。

本研究在前期工作的基础上，对膀胱癌与正常对照的14个尿液差异蛋白质进行了蛋白水平、基因水平及信号通路的系列信息学分析。通过信息学分析和文献检索，发现我们研究中的8个蛋白（B2-MG、A-FBAP、GSN、Isoform 1of GSN、Protein AMBP、MYO、ApoA-I、CK-8）在文献中曾报道过，其表达失调与膀胱癌的发生发展可能有关，剩余4个（Isoform 2 of Fibrinogen alpha chain、TTR、LPGDS和CK-1）目前尚未见到与膀胱癌相关的报道。这些报道中大部分的样本来自于组织、血清或血浆，尿液相关的研究甚少。部分蛋白的表达与膀胱癌的相关性仍在讨论中，如MARCHEWKA等［8］检测了34名膀胱癌患者的血清和尿液中的β2-MG的表达水平，结果显示随着膀胱癌恶性度的增高其水平也逐渐增加。而ZHANG等［9］报道的β2-MG在膀胱正常上皮及良性肿瘤的上皮中均正常量表达，而随着膀胱癌恶性度的增加，β2-MG 的表达量逐渐下降甚至缺失。KUWAMURA等［10］在一只纽芬兰犬的膀胱里发现了横纹肌肉瘤，免疫组化染色提示抗-MYO阳性，但TERADA［11］报道的一例79岁男性的膀胱肉瘤的免疫组化染色提示MYO阴性，该肉瘤的组成包括10%的高分化的移行细胞癌和90%的肉瘤。关于MYO与膀胱癌的相关性仍存在争议。

KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具，提供的整合代谢途径包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB库的链接等等。通过KEGG我们分析了膀胱癌相关分子相互作用和反应网络的通路图，主要包括6条分子途径：MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Cell cycle、p53 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Adherens junction，每条途径又包含了若干子途径。WARRICK等［12］在研究PPARα和γ激动剂在膀胱致癌力的研究中发现PPARα和PPAR γ之间的相互激活诱导了Egr-1转录因子的表达，而Egr-1转录因子是致癌标志物之一。从KEGG通路途径中，我们发现ApoA-I参与了PPAR信号通路，通过GeneCoDis平台我们找到了鉴定的14个蛋白间可能存在相互关系的基因群，例如KRT8、KRT1、FGA、APOA1、FABP4、ALB、GSN、B2M、MASP2、TTR等10个基因在一个群内，其中KRT8、APOA1、GSN、B2M、FABP4均有与膀胱癌的相关报道，在致癌机制上是否会有共性？

通过膀胱癌尿液差异蛋白的信息学分析，我们了解了鉴定出的14种蛋白的基本理化性质，在基因水平上进行了本体注释，涵盖分子功能、细胞组成、生物进程等。通过综合分析，使14种差异蛋白的相互关系更清晰明了，通过后期的文献检索，不仅对最初筛选的蛋白进行了初步的验证，也为下一步靶蛋白的研究提供方向。结合KEGG和GeneCoDis建立了基因、蛋白与疾病间可能存在的相互关系，为进一步研究疾病的发病机制提供了思路。