蒽酮-硫酸法测定复方木鸡颗粒中粗多糖

谢心文, 门 磊,2*, 孙 怡, 顾 喆, 寇佳怡, 魏溪垚

(1.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连116600；2.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室,辽宁大连116600)

复方木鸡颗粒来源于满族民间验方“木鸡汤”,收载于《中药成方制剂》 第十六册,其疗效确切,具有扶正清热解毒功效,能抑制甲胎蛋白升高,调节免疫功能,临床上用于治疗原发性肝癌、肝硬化、肝炎等肝脏疾病。它由云芝提取物、核桃楸皮、山豆根、菟丝子4 味药材制成,每味药中都含有多糖［1-7］。

目前研究发现,中药多糖具有多种生理活性,具有较好调节肿瘤免疫应答作用［8-10］,复方木鸡颗粒中该成分很可能是其保肝作用的重要药效物质基础,但现行标准缺少其含有量测定项。因此,本实验采用蒽酮-硫酸法测定复方木鸡颗粒中粗多糖的含有量,为该制剂质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 UV-2600 型紫外分光光度计(日本岛津公司)；DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)；MS 1 Minishakers ［艾卡 (广州) 仪器设备有限公司］；PL203 型电子精密天平［梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司］。

1.2 试药 复方木鸡颗粒(每袋装10 g),购自丹东药业集团有限公司,批号170201、170203、170101、170304、170303、170301。葡萄糖对照品(含有量≥99.8%,北京索莱宝科技有限公司,批号1102A0936)。硫酸为优级纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖对照品100 mg,置于100 mL 量瓶中,蒸馏水溶解定容,摇匀,得1 mg/mL 贮备液,精密量取适量,加水稀释,即得(0.1 mg/mL)。

2.2 供试品溶液制备 将颗粒研磨至粉末状,精密称取0.5 g,加入50 mL 无水乙醇,70 ℃下加热回流2 h,滤过,残渣挥至无醇味,将残渣、滤纸置于烧瓶中,加入50 mL水,80 ℃下回流提取2 次,每次2 h,趁热过滤,残渣、烧瓶用热水洗涤,洗液与滤液合并,浓缩转移至100 mL 量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,精密量取0.2 mL 至50 mL量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 检测波长确定 精密量取0.1 mg/mL 对照品溶液2.0 mL,置于20 mL 带塞试管中,加入0.1%蒽酮-硫酸溶液,涡旋混匀,水浴加热15 min,冰水冷却15 min；另取2.0 mL 蒸馏水同法操作,作为空白对照,于400 ～800 nm波长处进行扫描。最终确定,检测波长为626 nm。

2.4 显色条件优化

2.4.1 单因素试验

2.4.1.1 蒽酮-硫酸溶液体积分数 取0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液5 份,每份2 mL,分别加入0.1%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%蒽酮-硫酸溶液,涡旋混匀,水浴加热20 min 后冰水冷却20 min,在626 nm 波长处测定吸光度,平行3 份,结果见图1,可知体积分数0.2%时吸光度最大。

2.4.1.2 蒽酮-硫酸溶液用量 取0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液5 份,每份2 mL,置于20 mL 具塞试管中,分别加入0.2%蒽酮-硫酸溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,涡旋混匀,水浴加热20 min 后取出,冰水冷却20 min,在626 nm 波长处测定吸光度,平行3 份,结果见图1,可知用量6 mL 时吸光度最大。

2.4.1.3 水解时间 取0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液5份,每份2 mL,置于20 mL 具塞试管中,加0.20%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL,涡旋混匀后水浴加热水解,时间分别为5、10、15、20、30 min,取出后冰水冷却20 min,在626 nm波长处测定吸光度,平行3 份,结果见图1,可知水解20 min时吸光度最大。

2.4.1.4 冷却时间 取0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液5份,每份2 mL,置于20 mL 带塞试管中,加入0.20%蒽酮-硫酸溶液6.0 mL,涡旋摇匀,水浴加热20 min 后取出,冰水冷却,时间分别2、5、10、15、20 min,在626 nm 波长处测定吸光度,平行3 份,结果见图1,可知冷却5 min 时吸光度最大。

图1 各因素对吸光度的影响

2.4.2 正交试验 在“2.4.1” 项下结果基础上,以蒽酮-硫酸溶液体积分数(A)、蒽酮-硫酸溶液用量(B)、水解时间(C)、冷却时间(D) 为影响因素,每个因素3 个水平,L9(34) 正交试验优化,因素水平见表1。由此可知,因素C、D 对显色效果的影响较大,B、A 次之,最优显色条件为A1B2C2D3,即蒽酮-硫酸溶液体积分数0.15%,蒽酮-硫酸溶液用量6.0 mL,水解时间10 min,冷却时间10 min。

表1 因素水平

2.5 线性关系考察 精密吸取0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL,置于25 mL 具塞试管中,补水至2 mL,冰浴中加入6 mL 0.15%蒽酮-硫酸溶液,涡旋混匀,沸水浴加热10 min 后冰水浴冷却10 min,于626 nm 波长处测定吸光度,平行3份,空白调零。以葡萄糖含有量为横坐标(X),吸光度为纵坐标(A) 进行回归,得方程为A ＝0.008 39C-0.001 15(r ＝0.999 1),在10 ～60 μg/mL 范围内呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密称取颗粒(批号160601) 0.5 g,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,精密量取2 mL,置于25 mL 具塞试管中,按“2.5” 项下方法于626 nm 波长处测定吸光度,平行5 次,测得其RSD 为0.85%,表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 精密称取颗粒(批号160601) 0.5 g,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,精密量取2 mL,置于25 mL 具塞试管中,按“2.5” 项下方法于626 nm 波长处测定吸光度6 次,每个样品重复3 次,测得其RSD 为0.76%,表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒(批号160601)0.5 g,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,精密量取2 mL,置于25 mL 具塞试管中,加入0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液0.4 mL,按“2.5” 项下方法于626 nm 波长处测定吸光度6 次,每个样品重复3 次,计算回收率,结果见表2。

2.9 样品含有量测定 取7 批颗粒,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,按“2.5” 项下方法于626 nm 波长处测定吸光度,计算含有量,结果见表3。

3 讨论

在提取方法选择上,本实验尝试了超声提取、浸提、回流提取,但浸提操作繁琐,易导致数据误差较大；超声提取尽管操作方便,但超声过程和多糖结构差异会影响提取效率,并导致多糖降解［11］,故最终采用回流提取法提取复方木鸡颗粒中粗多糖。同时,为了消除木脂素、单糖等杂质对多糖质量分数测定的影响,先采用乙醇回流提取以去除杂质。

表2 粗多糖加样回收率试验结果（n=6）

表3 粗多糖含有量测定结果

蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法是测定多糖含有量较经典有效的方法,但后者还需制备5%苯酚,而且该成分易氧化；前者在回归方程线性关系、稳定性、重复性方面均优于后者［12］。因此,本实验采用蒽酮-硫酸法,并优选了显色条件,可为相关测定条件选择提供参考。

多糖是中草药有效成分之一,主要从调节免疫功能,激活网状内皮系统、巨噬细胞等方面生成抗体,增强干扰素、淋巴因子等细胞因子,最终全面提升机体免疫功能［13］。目前,复方木鸡颗粒在临床上已广泛用于治疗肝炎,但其所含多糖的具体药理作用尚不明确,尚需进一步研究。