6 省13 个产地颠茄草中2 种成分测定及相关性分析

吴玉婷, 吕伟旗, 汤晟凌,2*

(1.丽水市人民医院,浙江 丽水323000；2.浙江中医药大学,浙江 杭州310053)

颠茄草系茄科多年生草本植物颠茄Atropa belladonna L.的全草,别名美女草、别拉多娜草,全草入药,主要用于胃痉挛,胃、十二指肠溃疡病,胆绞痛,输尿管结石等引起的腹痛,胃炎及胃痉挛引起的呕吐和腹泻,迷走神经兴奋导致的多汗、流涎、心率慢、头晕等［1-2］, 含有生物碱［3］、 黄酮类［4］、苷类［5］等成分,具有镇痛、抗炎、活血等药理活性［6-8］,原产欧洲中、南部及小亚细亚,我国部分省市有引种栽培,主要集中在山东、湖南、河南、浙江等地［9-10］。目前,其相关研究主要集中在栽培技术［11］、 组织快繁［12］、 提取工艺［13］、 植物再生体系［14］、单一成分含有量测定［15］等方面,而对不同产地多样本活性成分含有量比较的研究较少。总生物碱与莨菪碱为2015 年版《中国药典》规定的颠茄草主要质量评价指标之一,具有抗炎、镇痛、缓解痉挛等功效［16-17］,故课题组收集我国颠茄草主要产区种质资源13 批,紫外可见分光光度法(UV-Vis) 法测定全草总生物碱含有量,反相高效液相色谱(RP-HPLC) 法测定莨菪碱含有量,考察其与生长性状、生境因子间的相关性,并进行主成分分析与聚类分析,以期为其质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 2017 年6 月至2017 年7 月,收集山东、湖南、河南、浙江、陕西、湖北6 省13 个产地颠茄草种质资源,由丽水市人民医院汤晟凌副主任药师鉴定为茄科植物颠茄Atropa belladonna L.的全草,详见表1。

1.2 仪器与试剂 Waters 600-2998 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；UV2550 紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)；Milli-Q Academic超纯水仪(美国Millipore 公司)；SHZ-95B 循环水式多用真空泵(长沙明杰仪器科技有限公司)；DGG-9070 电热恒温鼓风干燥器(上海森信试验仪器有限公司)；FA2004 电子分析天平(上海恒平精密电子仪器有限公司)；JP-180ST 超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；XL-02A 手提式粉碎机(杭州旭众机械设备有限公司)。莨菪碱对照品(SH8960,含有量≥98.0%) 购于北京索莱宝科技有限公司。甲醇(色谱级) 购于德国默克公司；其他试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.3 试验方法

1.3.1 生境因子与生长性状考察 记录每个颠茄草产地经度、纬度、海拔,卷尺测量株高,游标卡尺与直尺测量主茎粗、叶长、叶宽、叶柄长,电子天平称量全株鲜重,统计每株萌蘖条数,生物学重复15 次。

1.3.2 总生物碱含有量测定［18］将颠茄草全株洗净,阴干,剪切成段,置于50 ℃烘箱烘至恒定质量,粉碎,过60 目筛。取样品粉末0.5 g,用适量氨水湿润, 密封放置 30 min, 加三氯甲烷10.0 mL,称定质量,水浴加热回流提取2 h,冷却至室温,补足减失质量,抽滤。取2 mL 滤液,三氯甲烷定容至10 mL,依次加入pH 4.5 的邻苯二甲酸氢钾缓冲液5.0 mL,0.04%溴甲酚绿溶液2.0 mL,剧烈振荡3 min,静置30 min,以三氯甲烷为空白对照,620 nm 下测定吸光度。以总生物碱吸光度为纵坐标(A),样品质量浓度为横坐标(X)进行回归,得方程A ＝13.498 2X-0.056 2(R2＝0.999 6),在0.02～0.20 mg/mL 范围内线性关系良好,平均加样回收率101.85%,RSD 1.09%。

1.3.3 莨菪碱含有量测定

1.3.3.1 色谱条件 Waters Xbridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相甲醇-乙酸缓冲液(20 mmol/L 乙酸铵,氨水调pH 至4.0)；体积流量1.0 mL/min；检测波长226 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

1.3.3.2 线性关系考察 分别配制50、 100、200、300、400、500 μg/mL 溶液,过0.45 μm 微孔滤膜,在“1.3.3.1” 项色谱条件下进样。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,得方程Y＝2 325.5X-9 048.9 (R2＝0.999 7), 在50 ～500 μg/mL 范围内线性关系良好。

1.3.3.3 供试品溶液制备 精密称取样品粉末0.5 g,依次加氨试液5.0 mL、三氯甲烷20 mL,充分混匀,25 ℃下超声提取(功率250 W、频率33 kHz)30 min,2 000 r/min 离心5 min,取上清,重复1 次,合并提取液,旋干,甲醇溶解定容至25 mL 量瓶, 取适量过0.45 μm 微孔滤膜, 在“1.3.3.1” 项色谱条件下进样。色谱图见图1。

1.3.3.4 稳定性试验 取S8 样品,按“1.3.3.3”项下方法制备供试品溶液,在“1.3.3.1” 项色谱条件下分别于0、2、4、8、16、24 h下进样,测得莨菪碱峰面积RSD 为1.04%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

图1 莨菪碱HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of hyoscyamine

1.3.3.5 精密度试验 取莨菪碱对照品溶液,过0.45 μm 微孔滤膜,在“1.3.3.1” 项色谱条件下进样6 次,测得莨菪碱峰面积RSD 0.54%,表明仪器精密度良好。

1.3.3.6 重复性试验 取S8 样品6 份, 按“1.3.3.3”项下方法制备供试品溶液,在“1.3.3.1”项色谱条件下进样,测得莨菪碱含有量RSD 为2.35%,表明该方法重复性良好。

1.3.3.7 加样回收率试验 精密称取莨菪碱含有量已知的S8 样品,按照低、中、高3 个质量浓度依次加入对照品溶液,按“1.3.3.3” 项下方法制备供试品溶液,在“1.3.3.1” 项色谱条件下测定,计算加样回收率,平行3 次,结果见表2。

表2 莨菪碱加样回收率试验结果（n=3）Tab.2 Results of recovery tests for hyoscyamine（n=3）

1.4 数据处理与分析 用DPS6.55、SPSS17.0、EXCEL2010 软件处理数据,采用单因素方差分析,聚类分析采用类平均法。

2 结果与分析

2.1 含有量比较 13 个产地颠茄草总生物碱、莨菪碱含有量存在差异, 平均值分别为1.30%、0.70%,其中湖南新田种质总生物碱含有量最高,为1.91%；河南罗山种质莨菪碱含有量最高,为0.95%；陕西汉阴种质总生物碱含有量与莨菪碱含有量均最低,分别为0.79%与0.50%；供试颠茄草总生物碱含有量均满足2015 年版《中国药典》规定的不低于0.30%的标准,见表3。

2.2 含有量变异规律 相关性分析显示,13 个产地颠茄草中总生物碱、莨菪碱含有量与植株生长形状、产地生境因子间关系密切,见表4。总生物碱、莨菪碱含有量与株高、主茎粗、分蘖数、叶长、叶宽、叶柄长、鲜重呈正相关关系,与株高相关性最高,相关系数分别为0.785 4、0.717 6；与叶长宽比、纬度、海拔呈负相关关系,与海拔相关性最高,相关系数分别为-0.660 7、-0.576 0；与经度相关性较低, 相关系数仅为0.079 6、-0.055 9,表明低纬度、低海拔地区栽培颠茄草有利于其总生物碱、莨菪碱含有量积累。

2.3 主成分分析 10 个生长性状与成分含有量信息可由4 个主成分概括,累计贡献率达94.32%,见表5。 由表可知, 第1 主成分特征根值为5.756 2,贡献率为63.95%,其中除叶长宽比特征根值为负值外,其余生长性状指标特征根值均为较大正值,构成变异主要来源,该主成分可定义为生长性状主因子；第2 主成分特征根值为1.869 9,贡献率为20.78%,其中叶长宽比特征根值为较大正值0.622 1,构成变异主要来源,此成分可定义为叶形指数因子；第3 主成分特征根值为0.554 7,贡献率为6.16%,其中总生物碱含有量、莨菪碱

含有量为较大正值,此成分可定义为生物碱含有量因子；第4 主成分特征根值为0.308 7,贡献率为3.43%,其中鲜重、叶宽为较大正值,构成变异主要来源,该成分可定义为生长性状次因子。主成分分析可有效缩减考察指标数量,避免单一指标的片面性和不稳定性,为优良种质筛选提供参考［19］。以第1 主成分Y(i,1)＞1 为入选标准,筛选出河南新县、河南罗山、湖南新田、浙江缙云、浙江磐安5个优良种质,表现出植株高、茎粗、叶片大而宽厚、生长势好、生物碱含有量高等优良性状。

表3 不同产地样品生长性状与2 种成分含有量比较（n=15）Tab.3 Comparison of growth traits and two constituents'contents of samples in different growing areas（n=15）

表4 2 种成分含有量与生长性状、生境因子相关性分析Tab.4 Correlation analysis between two constituents'contents and growth traits，habitat factors

表5 主成分特征值和贡献率Tab.5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

2.4 聚类分析 以筛选出的4 个主成分为参考指标,对13 个产地颠茄草进行聚类分析,根据欧式距离D2＝19.74 的聚类水平,将供试颠茄草划分为4 个类群,见图2。类群Ⅰ共6 个种质,分别为山东栖霞、湖北恩施、山东兰陵、湖北竹山、陕西汉阴与陕西杨凌,该类群主要为山东、湖北、陕西种质,植株较矮、茎细、分蘖能力弱、叶片小而宽厚或狭长,生物碱含有量低；类群Ⅱ共2 个种质,为湖南涟源与湖南株洲,该类群植株中等高度,茎较粗,分蘖能力强,叶片较大而狭长,其中湖南涟源种质生物碱含有量较低,而湖南株洲生物碱含有量较高；类群Ⅲ与类群Ⅳ共5 个种质,分别为湖南新田、湖南新县、河南罗山、浙江缙云与浙江磐安,此2 类群植株较高,茎粗,分蘖能力强,叶片大而多宽厚,生物碱含有量较高,性状表现优良,见图2。

图2 13 批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of thirteen batches of samples

3 讨论

颠茄草是我国民间传统用药,也是提取莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的主要植物原料,常制备成流浸膏、浸膏、酊剂、片剂等成药制剂供临床使用,具有镇痛、解痉等作用［20］。目前野生颠茄资源日益匮乏,人工栽培受地域限制,栽培种质混乱,不同产地颠茄在生长性状、活性成分含有量等方面存在差异,故对其进行资源收集与评价,进而筛选优良种质,为相关产业发展与资源利用奠定良好基础。本研究考察了提取方法(索式、回流、超声)、提取温度(20、25、30、35 ℃)、提取时间(30、40、50 min) 对颠茄草中莨菪碱含有量的影响,发现在25 ℃下超声提取2 次(30 min/次、功率250 W、 频率33 kHz) 即可提取完全, 在“1.3.3.1”项条件下莨菪碱出峰时间为19.356 min,分离度大于1.5,理论塔板数大于3 500,定量限4.32 μg/mL,检测限1.56 μg/mL,而且该方法操作简便,重复性好,准确度高,可用于颠茄草药材质量评价。

植物在长期生物进化过程中为了适应外界环境,包括生物性环境因子(害虫、微生物) 与非生物性环境因子(经纬度、海拔、温度、光照)等,形成了一整套生物防御应答系统,根据不同环境刺激来激活细胞表面应答信号,进而启动防御生物链,上调相关基因表达,释放抗性因子［21］,植物积累的次生代谢产物是植物防御应答系统的重要组成部分。本研究结果表明,13 批颠茄草中总生物碱、莨菪碱平均含有量分别为1.30%、0.70%,前者满足2015 年版《中国药典》 规定的不低于0.30%的标准；我国颠茄草主产区药材中两者含有量存在差异,变幅分别为0.79%～1.91%、0.50%～0.95%,可为良种选育提供丰富的备选种质。