一测多评法同时测定蜘蛛果中3 种成分

刘梦鸽, 徐文芬, 孙庆文, 杨 杭, 刘恩稳

(贵州中医药大学,贵州 贵阳550002)

蜘蛛果来源于桔梗科金钱豹属多年生植物长叶轮钟草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz 的干燥根,又称“红果参” “山荸荠” “算盘果” 等。味甘而微苦,性平,具有润肺止咳、理气、补虚、祛瘀止痛等功效,主要用于治疗跌打损伤、气虚乏力、肠绞痛、肺痨咳嗽、疝气等症［1-2］。其根在民间常作为滋补草药,嫩叶可作为蔬菜炒食,果实可作为水果食用,有一定的保健功效［3］。对蜘蛛果药材的研究相对较少,主要集中在其化学成分及抗氧化活性的研究［4-9］,在质量控制方面仍处于空白,不利于控制药材及其成方制剂的质量,无法保证临床用药的安全性和有效性,并限制了对蜘蛛果的进一步开发利用。

中药的化学成分种类繁多,且各成分之间相辅相成,而中药的质量长期以来多以单一指标进行控制,难以真正体现中药的多效性和整体性。中药多靶点的作用特点要求对其进行多成分质量控制,一测多评(QAMS) 中药质量评价模式为解决该矛盾提供了新思路。QAMS 法是现代发展起来的1 种分析技术和方法［10］,即利用有效化学成分间内在的函数和比例关系,测定1 个成分(对照品可廉价易得者),实现对多个成分(对照品没有或难以得到者) 的同步监控,使中药质量评价更简便并节约成本,可客观评价中药的质量。目前,QAMS 法已广泛应用于中药材及中药制剂的质量控制研究中,用于解决缺乏对照品的问题［11-19］。

蜘蛛果为2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》 修订的新增补品种。 本研究应用QAMS 法以供应量大、价格较低的绿原酸对照品为参照物,通过建立其与木犀草素、芹菜素的相对校正因子进行含有量计算,以降低检测成本和时间,并为该药材质量标准的制定、合理开发利用资源等提供研究基础。

1 材料

Agilent 1100 型和1260 型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)；岛津LC-2030 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Thermo UItiMate 3000 型高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；AG135 型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)；SG8200HFT 型超声仪(上海冠特超声仪器有限公司)；202-1A 型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；DK-98-Ⅱ型水浴锅 (天津市泰斯特仪器有限公司)；色谱柱：Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、 Agilent ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent ZORBA XSB-CN(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 均 购 自 美 国 Agilent 公 司；Pntulips BP-C18(4.6 mm×250 mm,5μm) 等。

绿原酸对照品(批号110753-201716,含有量99.3%)、木犀草素对照品(批号111520-201605,含有量99.6%)、 芹菜素 (批号111901-201603,含有量99.2%) 均购于中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯)；磷酸(重庆川东化工有限公司,分析纯)；实验用水为重蒸馏水； 其他试剂均为分析纯。

17 批蜘蛛果药材分别由课题组采自贵州龙里、独山、开阳、梵净山以及广西省融水等地,经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为长叶轮钟草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz,按地上部分和地下部分分别处理,药材均抢水洗,50 ℃烘干,粉碎,置于硅胶干燥器中备用,见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Pntulips BP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -甲醇(B) -0.1%磷酸(C),梯度洗脱,程序见表2；体积流量1.0 mg/mL；检测波长340 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 对照品溶液制备 取绿原酸、木犀草素、芹菜素对照品适量,50%甲醇溶解并制成质量浓度分别为1.405、0.202 0、0.206 0 mg/mL 的贮备液,吸取2.0、2.5、0.5 mL,置于5 mL 量瓶中,定容,即得(三者质量浓度分别为0.562 0、0.101 0、0.020 6 mg/mL)。

2.3 供试品溶液制备 取药材粉末1.0 g,精密称定,置于50 mL 锥形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,超声(100 W、40 Hz)提取60 min,取出放至室温,滤过,续滤液过0.45 μm 微孔滤膜,即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性及专属性考察试验 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液和“2.3” 项下供试品溶液各10 μL,在“2.1.1” 项色谱条件下测定,记录色谱图。结果表明,供试品图谱中1、2、3 号色谱峰的保留时间与混合对照品溶液一致,且UV 光谱图曲线相同, 其纯度因子分别为 999.916、999.891、999.155,表明该方法具有良好的专属性,结果见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液,分别稀释成系列质量浓度(绿原酸,0.351 3、0.175 6、0.087 80、0.043 90、0.022 00 mg/mL；木犀草素,0.101 0、0.050 50、0.025 25、0.012 62、0.006 312 mg/mL；芹菜素,0.041 20、0.016 48、0.006 592、0.002 637、0.000 527 4 mg/mL),在“2.1” 项色谱条件下测定,平行3 次。以对照品进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表3。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液10 μL,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次,测得绿原酸、木犀草素、芹菜素峰面积RSD分别为0.26%、0.74%、0.26%,表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(Z7)10 μL,在“2.1” 项色谱条件下于0、3、6、8、12、24、48 h 进样,测得绿原酸、木犀草素、芹菜素峰面积RSD 分别为0.67%、1.51%、1.94%,表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一样品(Z7) 6 份,每份约1.0 g,精密称定,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,测得绿原酸、木犀草素、芹菜素含有量RSD 分别为2.59%、1.41%、2.55%,表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取含有量已知的药材粉末(Z7)6 份,每份约0.5 g,精密称定,分别精密加入绿原酸、木犀草素、芹菜素对照品溶液适量,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下测定,测得三者平均加样回收率分别为96.00%、96.34%、95.93%,RSD 分别为1.54%、2.45%、2.53%。

2.5 相对校正因子 取“2.2” 项下对照品溶液,精密吸取2、4、6、8、10、12 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样,以绿原酸为内标,根据校正因子公式fsi＝fs/fi＝ (As×Ci) / (Ai×Cs) (As、Cs分别为内参物的峰面积和浓度,Ai、Ci分别为待测成分的峰面积和浓度,fsi为待测成分的相对校正因子)分别计算绿原酸对木犀草素和芹菜素的相对校正因子(fS/B为木犀草素的相对校正因子,fS/C为芹菜素的相对校正因子),发现其RSD 均小于5.0%,见表4。

表4 木犀草素、芹菜素校正因子（n=6）Tab.4 Relative correlation factors of luteolin and apigenin（n=6）

2.6 耐用性考察

2.6.1 仪器、色谱柱 选择4 种型号高效液相色谱仪和3 种型号色谱柱,精密吸取“2.2”项下对照品溶液10 μL,在“2.1”项色谱条件下进样,测得木犀草素、芹菜素相对校正因子分别在0.578～0.617、0.471～0.551 之间,不同仪器、色谱柱相对校正因子RSD 分别为2.222%、3.793%,表明对各成分相对校正因子无显著性影响,结果见表5。

2.6.2 待测组分色谱峰定位 本实验考察4 个实验室中不同型号仪器、色谱柱下的保留时间差和相对保留时间,发现各成分保留时间差波动较小,RSD 分别为1.93%、3.03%；相对保留时间波动较大,RSD 分别为6.25%、5.39%,因此采用保留时间差法定位木犀草素、 芹菜素色谱峰, 结果见表5。

2.7 样品含有量测定 取17 批样品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,分别采用外标法和一测多评法计算3 种成分的含有量,并对2 种方法测定值进行比较,结果见表6。

表5 相对校正因子、保留时间差和相对保留时间考察结果（n=3）Tab.5 Results of investigation on relative correlation factors，retention time differences and relative retention time（n=3）

3 讨论

3.1 流动相优化 本实验考察了甲醇-水、乙腈-水流动相系统,发现峰形较差。在此基础上,又考察了甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%磷酸流动相体系及其比例,结果显示,以甲醇-乙腈-0.1 磷酸水为流动相时,待测成分色谱峰峰形较好,分离度≥1.5。

3.2 检测波长筛选 本实验对绿原酸、木犀草素、芹菜素溶液进行全波长扫描时发现, 三者在340 nm波长下均有较好的吸收,而且基线平稳,色谱峰峰形较好,故选择其作为检测波长。

3.3 制备方法优化 本实验考察了提取溶剂(50%、75%、95%甲醇,75%乙醇)、 制备方式(超声、回流提取)、提取时间(30、45、60 min)等,以各成分提取率和色谱峰分离情况为指标,同时考虑到样品制备的便捷性,最终确定供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。

表6 一测多评法与外标法含有量测定结果比较（n=3）Tab.6 Comparison of content determination results obtained by ESM and QAMS methods（n=3）

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定蜘蛛果药材中绿原酸、 木犀草素、 芹菜素的含有量。 再采用SPSS16.0 软件,对外标法和一测多评法所测的蜘蛛果中木犀草素、芹菜素含有量进行独立样本t 检验,结果P＞0.05,表明2 种方法所得结果无显著性差异,准确可靠。而且,该方法简单、快速、准确,相对校正因子具有良好的可信度和准确度,同时有效降低了分析成本,可为该药材质量标准的建立提供有力支持。

此外,不同采收时间的蜘蛛果中3 种成分含有量均存在显著差异。据现有数据可知,从1 月到7月呈下降趋势；不同产地采收的药材中3 种成分含有量同时高或同时低,其变化趋势相同,见图2 ～3,可初步判断不同采收期、产地对其影响较大,不同季节、环境因素也可能影响其变化,但还需要更多样本来验证此推断。本研究结果对蜘蛛果种质资源引种、规范化种植、采收时间等方面研究提供了前期基础。

图2 不同采收期样品中3 种成分含有量变化趋势Fig.2 Trends of content changes of three constituents in samples at different picking time

图3 不同产地样品中3 种成分含有量变化趋势Fig.3 Trends of content changes of three constituents in samples from different growing areas