HPLC 法同时测定桑白皮中5 种成分

袁 婷, 郑甜碧, 谢鲁灵枫, 成胜荣, 魏 渊, 欧阳 臻

(江苏大学药学院,江苏 镇江212013)

桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮,秋末叶落时至次春发芽前采挖根部,刮去黄棕色粗皮,纵向剖开, 剥取根皮, 晒干, 其性甘、寒,归肺经,具有泻肺平喘、利水消肿的功效,主要用于治疗肺热喘咳、水肿胀满、尿少、面目肌肤浮肿等疾病［1］,含有黄酮类、茋类、多羟基生物碱类、Diels-Alder 型加合物、三萜、甾体、多糖、氨基酸等多种化学成分［2-6］。现代药理研究表明,桑白皮具有利尿、镇咳、平喘、降血压、降血糖、抗癌等多种药理活性［7-11］,但2015 版《中国药典》桑白皮仅以外观性状、显微、薄层鉴别作为质量控制的标准,未对内在成分进行分析。本研究前期通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS) 法对桑白皮药材甲醇提取物进行分析,鉴定出7 个化合物,分别是绿原酸、二氢桑色素、氧化白藜芦醇、桑辛素O、桑根酮C、桑根酮醇A 和桑根皮醇,选择其中5 个含有量较高的(绿原酸、二氢桑色素、氧化白藜芦醇、桑辛素O、桑根酮C) 进行测定,建立HPLC 法同时测定其含有量。桑白皮传统上以色白、皮厚、粉性足者为佳［12］,本实验选择桑白皮药材厚度作为指标,分析桑白皮药材厚度与这5 种成分之间的相关性,以期为其质量控制提供依据。

1 材料

安捷伦1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；HH-S 数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)；ZF 超声波清洗机(上海致丰科技有限公司)；DHG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；FA1204B 分析天平(上海精科-上海天平仪器厂)。

对照品绿原酸(327-97-9) (南京源植生物科技有限公司)；二氢桑色素(BBW-148746) (北京百欧博伟生物技术有限公司)； 氧化白藜芦醇(RM-0489) (成都麦德生科技有限公司)；桑辛素O(BBW-148745) (北京百欧博伟生物技术有限公司)；桑根酮C(GCB-111450) (上海颖心实验室设备有限公司)。桑白皮购自安徽亳州、四川荷花池、河北安国、广西玉林中药材市场,同时在江苏、安徽、四川等地采集,均为生品,由江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮,具体见表1。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Dimonsiol C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.2% 甲酸(B),梯度洗脱(0 ～10 min,20%～35%A；10 ～15 min,35%～50%A；15 ～25 min,50%～60%A；25～30 min,60%A；30 ～50 min,60%～80%A)；体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长340 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

2.2 供试品溶液制备 药材粉碎,精密称取1 g,置于50 mL 圆底烧瓶中, 加入20 mL 甲醇, 于70 ℃水浴加热回流1 h,滤过,定容至25 mL,过0.45 μm 微孔滤膜,即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、二氢桑色素、氧化白藜芦醇、桑辛素O、桑根酮C 对照品0.52、0.77、0.86、0.30、1.79 mg,甲醇溶解并定容于5 mL 量瓶中,即得。

2.4 线性关系考察 按“2.3” 项下方法制备对照品溶液,逐级吸取1 mL 定容至2 mL,稀释成不同质量浓度的6 份溶液,分别进样10 μL。以峰面积为纵坐标 (Y), 对照品质量浓度为横坐标(X),进行回归,结果见表2。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取同一供试品溶液,在“2.1”项条件下连续进样6 次,每次10 μL,测得各成分峰面 积 RSD 分 别 为 1.99%、 0.86%、 0.87%、1.09%、0.96%,表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批样品6 份,按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项条件下进样10 μL,测得各成分峰面积RSD 分别为0.80%、2.76%、 1.98%、 1.57%、 0.79%, 表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,在“2.1”项条件下于0、1、2、4、8、16、24 h 各进样10 μL,测得各成分峰面积RSD 分别为1.99%、1.95%、1.37%、2.30%、0.92%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取含有量已知的同一批药材,精 密 加 入 含0.822、 0.208、 0.232、 0.084、0.718 mg/mL 绿原酸、二氢桑色素、氧化白藜芦醇、桑辛素O、桑根酮C 的对照品溶液0.60、0.80、1.00 mL,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在 “2.1” 项条件下进样, 计算回收率,见表3。

2.9 样品含有量测定 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项条件下进样,测定各样品中绿原酸、二氢桑色素、氧化白藜芦醇、桑辛素O、桑根酮C 的含有量,结果见表4,可知各种成分含有量差异较大。

2.10 外观性状与化学成分相关性 以药材厚度为外观性状指标进行测定,结果见表5；采用SPSS 20.0 软件对各成分与药材厚度进行相关性分析,结果见表6,表明药材厚度与二氢桑色素、桑辛素O 含有量呈显著正相关,与桑根酮C 含有量呈极显著正相关。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

续表4

表5 各样品厚度（mm，Tab.5 Thickness of various samples（mm，

表5 各样品厚度（mm，Tab.5 Thickness of various samples（mm，

样品 厚度 样品 厚度 样品 厚度S1 3.4±0.89 S17 3.3±0.88 S33 2.3±0.59 S2 3.3±0.94 S18 3.0±0.86 S34 2.3±0.72 S3 1.9±0.63 S19 3.0±1.37 S35 4.5±0.73 S4 1.4±0.39 S20 2.9±0.86 S36 2.4±0.57 S5 1.5±0.43 S21 2.7±1.01 S37 2.5±0.43 S6 1.7±0.41 S22 2.6±0.83 S38 2.5±0.95 S7 2.4±0.61 S23 2.6±0.80 S39 2.7±1.06 S8 2.5±0.92 S24 3.0±0.65 S40 1.9±0.50 S9 3.2±1.08 S25 2.6±0.99 S41 1.2±0.24 S10 2.2±0.81 S26 2.3±0.67 S42 2.5±0.57 S11 1.2±0.32 S27 2.4±0.55 S43 2.7±0.76 S12 1.1±0.27 S28 2.9±0.74 S44 2.5±0.91 S13 1.2±0.30 S29 1.6±0.42 S45 2.4±0.75 S14 2.9±1.14 S30 3.2±1.11 S46 3.0±0.80 S15 2.7±0.76 S31 2.7±0.83 S16 3.2±1.09 S32 2.6±0.56

表6 各样品外观性状与化学成分相关性Tab.6 Correlation of appearance and chemical composition of various samples

3 讨论

3.1 提取溶剂选择［13-15］本实验考察了甲醇和70%乙醇溶剂的提取效果,比较各成分的峰形和含有量,最终选择甲醇作为提取溶剂。

3.2 检测波长选择 为了提高方法的准确度和灵敏度,在358、340、280 nm 波长下进行考察,发现340 nm 波长下色谱图峰形良好,基线平稳,故选择其作为检测波长。

3.3 流动相选择［13-15］本实验考察了甲醇-0.2%醋酸、乙腈-0.2%醋酸2 种流动相体系,发现乙腈-0.2%醋酸洗脱时峰形良好,各成分能有效分离。

3.4 中药质量标志物选择 中药质量标志物是中药材和中药产品中固有或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质,作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制［16-17］。本研究前期通过LC-MS 法对桑白皮甲醇提取物进行分析,选择了其中含有量较高的5 个化合物,其中绿原酸具有抗癌、抗病毒作用［13］,二氢桑色素、氧化白藜芦醇具有抗氧化、神经保护作用［18］,桑辛素O 具有抗癌作用［19］,桑根酮C 具有降血压作用［20］。

2015 版《中国药典》 无桑白皮内在成分指标,传统上以色白、皮厚、粉性足者为佳。本实验建立HPLC 法分析了46 批样品中5 种成分的含有量,发现其厚度与二氢桑色素、桑辛素O 含有量呈显著正相关,与桑根酮C 含有量呈极显著正相关,表明药材厚度与化学成分之间存在一定相关性。因此,建议将二氢桑色素、桑辛素O、桑根酮C 作为桑白皮质量控制指标成分,含有量分别不低于0.12、0.05、0.31 mg/g。