芍药苷对髓核细胞增殖的影响

王新立, 刘汝银, 王西彬, 岳宗进

(河南省中医院,河南 郑州450000)

椎间盘突出以颈肩腰腿痛为主要临床症状,其重要原因是椎间盘的退行性变化［1］,最关键的变化是髓核细胞减少,从而髓核基质中主要成分含有量降低［2］。因此,促进髓核细胞生长活力和增殖能力对防治椎间盘退变具有重要意义。

芍药苷是芍药主要有效成分,具有抗炎、调节免疫、影响细胞增殖的作用［3-4］,可调节多种细胞增殖,并能抑制髓核细胞凋亡［5］,但对其增殖作用尚不明确。文献［6-7］ 报道,芍药苷可抑制大脑中c-fos 表达,并且后者具有调节成骨细胞p27表达的作用,p27(p27kip1) 是细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CDKI) 家族成员之一,可调控细胞周期、凋亡、增殖［8］。因此,本实验探讨芍药苷对髓核细胞增殖的影响及相关作用机制。

1 材料

胎牛血清和DMEM/F12 购自美国HyClone 公司；反转录试剂盒、XhoI、EcoRI、Turbofect 购自美国赛默飞世尔科技公司；BCA 试剂盒购自美国Pierce 公司；pcDNA3.1、SYBR Green I Prmix 购自大连宝生物工程有限公司；BrdU ELISA 试剂盒购自上海麦约尔公司；c-fos、p27、Ⅱ型胶原、Aggrecan、GAPDH 兔抗购自美国CST 公司；山羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；MTT购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。

2 方法

2.1 细胞分离培养 1%戊巴比妥钠麻醉7 周龄雄性SD 大鼠(体质量220～250 g),无菌条件下切除全部脊柱,收集大鼠腰椎间盘,切开外层纤维环,将胶冻状髓核完整取出,磷酸盐缓冲液冲洗3 次,将分离组织用胶原蛋白酶处理3 h 后,DMEM/F12(含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素) 于37 ℃、5%CO2下培养1 周,细胞贴壁生长,倒置相差显微镜下用细胞刮刀刮除长梭形纤维细胞,待圆形或短梭形髓核细胞长成单一克隆体时,0.25%胰酶消化且接种于新培养瓶继续培养。细胞达90%融合后传代,用第三代细胞进行实验。

2.2 细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan 免疫组织化学染色鉴定 第3 代髓核细胞爬片,室温下多聚甲醛固定,40 min 后0.3%TritonX-100 孵育25 min, 含3%H2O2的甲醇室温下作用20 min 后滴加山羊血清,室温下反应25 min。去除血清,分别滴加Ⅱ型胶原多抗(1 ∶80) 和Aggrecan 单抗(1 ∶200),湿盒4 ℃下过夜,PBS 洗净滴加辣根过氧物酶标记的二抗,室温下孵育25 min,PBS 冲洗,DAB 显色10 min 后用PBS 冲洗,苏木精复染,冲洗,脱水封片。显微镜下随机检测10 个视野(×200),每个视野检测20 个细胞,总共200 个,分别计数Ⅱ型胶原和Aggrecan 免疫组织化学染色阳性细胞数,计算该细胞百分比,即髓核细胞纯度。

2.3 细胞生长活力测定 将髓核细胞(1×105/孔)接种于96 孔板,不同浓度(0、0.5、1、2、5、8、10、15、 20、 25 μmol/L) 芍 药 苷 处 理, 于5%CO2,37 ℃下培养24 h 后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL) 培养5 h。 去掉培养基, 每孔加入150 μL二甲基亚砜,溶解蓝紫色结晶甲瓒,酶标仪测定490 nm 处光密度,重复3 次,取平均值。

2.4 BrdU 检测 通过BrdU ELISA 试剂盒检测细胞增殖情况,按照说明书进行操作,酶标仪检测370 nm 处光密度以反映细胞增殖变化。每组3 个复孔,重复3 次,取平均值。

2.5 qRT-PCR 检测 Trizol 试剂裂解细胞提取总RNA 并作为模板,反转录试剂盒合成cDNA,进行qRT-PCR 反应,GAPDH 为内参,反应条件为预变性94 ℃5 min,94 ℃20 s,58 ℃ (c-fos) 或60 ℃(p27)25 s,共40 个循环,延伸72 ℃10 min。反应体系20 μL,含10 μL SYBR Premix Ex Taq II,cfos 正向5′-GTGGTGGAAGGCGTATCGAGTTT-3′,反向5′-GTGTGATGCCAGAAGCAGATCCA-3′； p27 正向5′-ATCCGTCGGACAGCCAGAC-3′,反 向5′-CACAGAACCGGCATTTGGG-3′。2-ΔΔCt法计算基因相对表达量,重复3 次,取平均值。

2.6 Western blot 检测 裂解细胞收集总蛋白,BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。将25 μg 蛋白加到聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行电泳,将凝胶上蛋白通过点转移转移到硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉溶液室温封闭膜2 h,加入c-fos 兔单抗(1 ∶500)、p27兔单抗(1 ∶500)、GAPDH 兔单抗(1 ∶1 000),4 ℃下孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1 ∶1 000) 室温下孵育2.5 h,洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗,室温下孵育1 h,暗室曝光观察结果。GAPDH 为内参对照蛋白,重复3 次,取平均值。

2.7 重组载体构建 Trizol 法提取细胞总RNA,将其反转录成cDNA,以其为模板,利用PCR 方法扩增c-fos (GenBank accession no：XM＿ 234422)全长且具有Xho 和EcoRI 酶切位点。反应条件为94 ℃6 min,94 ℃25 s,56 ℃50 s,72 ℃1 min,共35 个循环,72 ℃10 min。XhoI 和EcoRI 双酶切c-fos 全长DNA 和pcDNA.3.1 质粒,并且将产物连接,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α 中,挑选阳性克隆37 ℃增殖重组质粒,提取质粒,测序,将正确的重组质粒命名为pcDNA.3.1-c-fos。

2.8 细胞转染 将髓核细胞接种于6 孔板中,37 ℃、5%CO2下培养24 h,参照Turbofect 操作说明进行细胞转染,将pcDNA.3.1-c-fos(6 μg)、pcDNA.3.1 (6 μg)、 p27 siRNA (5′-GCCAGCGCAAGUGGAAUUUCGAUUU-3′,6 μg)、 non-specific siRNA(6 μg) 分别与6 μL Turbofect 混合后加入各孔中,5%CO2条件下转染24 h。 然后, 通过qRT-PCR、Western blot 检测转染效率。

2.9 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理,数据以表示,2 组间比较采用t 检验,多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 髓核细胞鉴定 图1 显示,细胞中呈现大量阳性表达,胞浆染成棕黄色,符合髓核特征,Ⅱ型胶原、Aggrecan 的免疫组化染色阳性细胞比例分别为97%、96%。

图1 Ⅱ型胶原和Aggrecan 免疫组化染色（×100）Fig.1 Immunohistochemistry staining of type II collagen and Aggrecan（×100）

3.2 芍药苷对髓核细胞增殖的促进作用 图2 显示,芍药苷终浓度8 μmol/L 时,细胞活力和增殖显著上调(P ＜0.05,P ＜0.01),但在25 μmol/L时两者反而有所下降。

图2 不同浓度芍药苷对细胞活力和增殖的影响Fig.2 Effects of different concentrations of paeoniflorin on cell viability and proliferation

3.3 芍药苷对c-fos 和p27 表达的抑制作用 图3显示,8 μmol/L 芍药苷作用于细胞24 h 后,c-fos、p27 mRNA、蛋白表达显著下降(P＜0.05,P＜0.01)。

图3 芍药苷对c-fos、p27 表达的影响Fig.3 Effects of paeoniflorin on c-fos and p27 expressions

3.4 芍药苷对p27 表达的调节作用 图4 显示,与pcDNA.3.1 组比较,pcDNA.3.1-c-fos 组c-fos mRNA、蛋白表达显著上调(P＜0.01),表明c-fos过表达成功,同时p27 mRNA、蛋白表达也显著上调(P＜0.01)。另外,8 μmol/L 芍药苷处理c-fos过表达细胞24 h 后,可显著抑制芍药苷对细胞增殖的促进作用。

3.5 芍药苷对细胞增殖的促进作用 图5 显示,与c-fos-non spe 组比较,p27 mRNA、蛋白表达显著降低(P＜0.01)。同时,8 μmol/L 芍药苷孵育c-fos 过表达和抑制p27 的髓核细胞24 h 后,细胞增殖显著高于c-fos-non spe 组(P＜0.01)。

4 讨论

椎间盘突出发生率呈上升趋势,退变后椎间盘髓核细胞数量减少,其分泌的Aggrecan 和Ⅱ型胶原也随之降低,导致椎间盘功能减弱,从而发生形态学变化,引发腰腿痛。临床上手术治疗只能缓解病痛,无法从根本上根治椎间盘退变［9-10］。

芍药苷是从芍药干燥根中提取出的有效成分,具有抗肿瘤、保护神经细胞等作用［11-16］,也可促进椎间盘纤维环细胞增殖［17］,促进骨髓间充质干细胞由G0/G1 期进入S 期来促进其增殖［18］,但目前还没有关于其对髓核细胞增殖影响的研究。本实验分离培养大鼠腰椎间盘髓核细胞,以不同浓度芍药苷处理24 h,发现该成分终浓度在8～20 μmol/L 时,细胞活力和增殖均显著上调,呈现剂量依赖性,但在25 μmol/L 时反而有所下降,故以8 μmol/L 芍药苷处理24 h 的髓核细胞为模型进行后续研究。

图4 c-fos 过表达对p27 表达、细胞增殖的影响Fig.4 Effects of c-fos overexpression on p27 expression and cell proliferation

图5 c-fos 过表达和p27 敲低对细胞增殖的影响Fig.5 Effects of c-fos overexpression and p27 knockdown on cell proliferation

文献［6］ 报道,芍药苷可抑制大脑中c-fos表达,该基因是即刻早期基因,调控多种细胞增殖能力,Long 等［19］发现MicroRNA-101 通过抑制c-fos来抑制膀胱癌细胞和骨肉瘤的增殖和侵袭；该基因表达量下调可抑制血管平滑肌细胞的增殖［20］；然而Mikula 等［21］研究表明其过表达可抑制肝癌细胞增殖能力,可见它对不同细胞增殖能力的调控作用有所差异；本实验发现,8 μmol/L 芍药苷处理24 h后髓核细胞c-fos 表达明显降低,而且c-fos 过表达可明显抑制髓核细胞增殖能力。研究表明,c-fos具有调节成骨细胞p27 表达的作用［7］,它通过多种方式参与细胞周期调控,抑制细胞分裂和增殖,如乳腺癌细胞、Neuro-2a 细胞、胃癌细胞等［22-23］,Qiu 等［24］发现其表达降低可有效促进肺腺癌细胞增殖；本实验发现,8 μmol/L 芍药苷处理髓核细胞24 h 后,p27 表达显著降低,而且c-fos 过表达可有效抑制芍药苷对其表达的下调作用。另外,在c-fos 过表达和芍药苷处理的髓核细胞中减弱p27表达时,可显著促进髓核细胞增殖,表明芍药苷通过调节c-fos 表达量来调控p27 表达,进而调控髓核细胞的增殖能力。

综上所述,芍药苷可促进髓核细胞增殖,呈现剂量依赖性,而且能抑制c-fos、p27 表达,并通过c-fos 调控p27,进而促进髓核细胞增殖。