不同方法分析工矿复垦区不同植物根际微生物多样性的比较

张变华　靳东升　郜春花　郜雅静　李建华

摘要：以山西古交屯兰工矿复垦区为研究对象，从不同植物种植、不同耕作制度的视角出发，将传统分析与现代技术分析相结合，分析比较工矿复垦区植物根际微生物的多样性，旨在为提高工矿区复垦的土壤质量提供理论依据。传统分析结果表明，豆科植物根际微生物细菌与放线菌的数量要高于禾本科植物，毛苕子根际细菌、放线菌数量与Shannon多样性指数均高于其他植物，在大豆—玉米—玉米轮作制度下，大豆根际细菌、放线菌数量与Shannon多样性指数高于玉米—大豆—大豆轮作制度下玉米根际的相应指标。用16S rDNA V3～V4区操作分类单元（operational taxonomic units，简称OTU）进行不同植物根际细菌α多样性分析，发现自然恢复土壤的Chao1丰富度高于种植植物的土壤，与种植植物根际土壤微生物的群落结构截然不同，连种毛苕子根际与玉米—大豆—大豆轮作制度下的玉米根际土壤具有丰度较低的相似性微生物属，大豆与苜蓿的根际微生物具有相似的亲缘性。

关键词：工矿复垦区;植物根际;微生物多样性;Shannon多样性指数

中图分类号： S154.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0223-04

土壤微生物是维持土壤活性的重要组成部分，参与有机质分解、养分转化和循环等多种生化过程，其多样性是评价土壤环境质量的重要生物学指标[1]。矿区复垦土壤具有有机质含量低、团聚体少、微生物活性差的特点，然而提高矿区复垦土壤质量可以缓解我国人均耕地少、质量差的现状，并保持农业可持续发展。根际是连接植物、土壤和微生物的纽带，植物根系通过分泌物、脱落物与植物残体等影响根际土壤微生物群落代谢与种群结构，进而改变根际土壤环境[2]。了解不同植被类型根际土壤的理化及微生物学特性，可以直接或间接反映植被对土壤的改良作用及植被恢复的生态效果。当前国内外的相关研究主要集中在根际与非根际土壤理化性质、土壤微生物多样性、土壤酶活性等方面[3-5]，目前仅有少量学者在工矿区开展了不同植物根际的评价研究[6-11]，对于山西工矿复垦区不同植物根际生物学性质的相关研究较少。因此，将山西省古交屯兰矿区复垦地作为试验区，研究在种植不同植物的条件下根际土壤微生物多样性特点具有重要意义，可以为土壤质量改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验区位于山西省古交屯兰工矿复垦区，于2014年开始复垦，试验时为复垦第4年，该区年均气温为9.5 ℃，平均降水量为460 mm，为温带大陆性气候，乡土作物为玉米、大豆。本试验设置5个小区，分别为大豆—玉米—玉米轮作区、玉米—大豆—大豆轮作区、连作苜蓿区、连作毛苕子区、自然恢复区。2017年，在大豆—玉米—玉米轮作区种植大豆，在玉米—大豆—大豆轮作区种植玉米。

1.2 材料与方法

土样采集。在2017年9月在各试验区内选择大小差不多的大豆15株，玉米5株;对于种植苜蓿、毛苕子与自然恢复的小区，划定1 m×1 m区域采集样品，设3次重复。采用抖落法[12]抖掉大块土壤，用毛刷轻轻地将根上0～5 mm的土壤刷下作为根际土，收集在无菌塑料袋中，再放入装有冰袋的保温箱内，带回实验室立即进行化验，不能进行及时化验的放入 -80 ℃ 冰箱中保存。

试验方法。（1）采用传统微生物培养法测定土壤微生物数量，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌培养采用高氏改良培养基，真菌培养采用孟加拉红培养基。微生物数量以单位质量（g）干土中的菌落数表示。（2）称取10 g根际土壤，放入灭菌的、装有90 mL 0.85% NaCl的带玻璃珠的三角瓶中，在旋转式摇床上于250 r/min充分振荡30 min，连续2次进行10倍稀释后，在Biolog生态微板的每个孔中加入150 μL土壤接种液，放入28 ℃培养箱中培养，用Biolog分析仪每隔24 h读取各孔的吸光度，连续测定7 d。（3）16S rDNA高通量测序，由上海派森诺生物公司对植物根际进行微生物组DNA提取、目标片段PCR扩增、产物回收纯化、荧光定量等，用MiSeq测序仪测定不同植物根际微生物V3～V4区的操作分类单元（operational taxonomic units，简称OTU）。

数据分析。用Excel、SPSS及R软件进行方差分析与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 传统微生物培养结果

2.1.1 细菌培养结果 从图1可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根际细菌数量要高于禾本科植物玉米的根际细菌数量，毛苕子根际土壤的细菌数量最多，根际土壤细菌数量排序为毛苕子>大豆>自然恢复>苜蓿>玉米。

2.1.2 放线菌培养结果 从图2可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根际放线菌数量要高于禾本科植物玉米的根际放线菌数量，但是苜蓿、玉米、大豆与自然恢复的根际放线菌数量相差不大，根际放线菌数量排序为毛苕子>苜蓿>大 豆> 自然恢复>玉米。

2.1.3 真菌培养结果 从图3可以看出，豆科植物苜蓿、大豆的根际真菌数量要高于禾本科植物玉米的根际真菌数量，也高于自然恢复的，连种毛苕子的根际真菌数量最少，各个条件下的真菌数量排序为大豆>苜蓿>自然恢复>玉米>毛苕子。

2.2 用Biolog生态微板分析微生物代谢功能的多样性

2.2.1 不同植物根际微生物群落土壤微生物的平均颜色变化率（AWCD）的动态变化 AWCD表示微平板孔中颜色的平均变化率，用来描述土壤微生物的代谢活性，计算公式如下：AWCD值=[∑（C-R）]/95[13]。其中：C是所测95个反应孔的吸光度，R是对照孔的吸光度。

从图4可以看出，不同植物根际微生物群落的AWCD值随着培养时间的增加均呈现增长的趋势，土壤微生物群落利用碳源的能力逐渐增强。从接种到培养24 h，各处理样品平均吸光度无明显变化，微生物几乎没有代谢碳源。在培养 24 h 后的任何时间段，毛苕子的AWCD值最高，说明其碳源利用速率高，根际土壤微生物活性较高。在培养24～48 h内，自然恢复（NR）的AWCD值要高于玉米、苜蓿，但是培养48 h后，其利用的碳源量虽然在逐渐增加，但是增长缓慢，在培养72 h后的任何时间段均低于种植其他植物的，且在培养72 h后的任何时间点，植物根际的AWCD值均表现为毛苕子>大豆>苜蓿>玉米>自然恢復。

2.2.2 不同植物根际微生物多样性指数的差异 微生物多样性指数表征整个生态系统中土壤微生物群落利用碳源类型的多少，即功能多样性。表征土壤微生物代谢功能多样性的指标为土壤微生物香农-维纳指数H′、Shannon多样性指数H、Mclntosh均一度指数U和Simpson优势度指数D[14]，计算公式见表1。

本研究采用96 h的数据来分析计算土壤微生物多样性指数，由表2可见，工矿区不同植物根际土壤微生物群落的优势度指数（D）均无显著差异，毛苕子根际土壤微生物群落Shannon指数H与均一度指数U显著高于其他植物（P<005），且根际土壤微生物群落香农-维纳指数H′也高于自然恢复与禾本科植物玉米。自然恢复的均一度指数与Shannon指数H最低，与玉米、苜蓿的香农-维纳指数H′均无显著差异，但是显著低于轮作大豆根际土壤微生物群落的香农-维纳指数H′（P<0.05），说明该矿区自然恢复的土壤微生物利用碳源的能力較差，代谢功能差，活性较低。而毛苕子根际土壤利用碳源的能力最强，活性最高。不同轮作制度下大豆与玉米相比大豆根际土壤活性较强，利用碳源能力高于玉米根际，在工矿复垦初期豆科与禾本科植物轮作与连作豆科植物对土壤微生物群落结构的影响不同。

2.2.3 16S rDNA根际细菌α多样性分析 微生物群落α多样性可以用多种指数来反映，本研究选用Chao1丰富度估计指数、Shannon多样性指数。一般而言，Chao1指数越大，表明群落的丰富度越高。Shannon多样性指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度。Shannon指数越高，表明群落的多样性越高。从表3可以看出，自然恢复的根际土壤Chao1指数最大，轮作大豆根际土壤的Chao1指数最小，苜蓿根际土壤的Shannon指数最高，而轮作玉米根际土壤的Shannon指数最小。

根据样本间的相似程度对丰度排名前50位的属进行聚类并绘制热图，对高丰度和低丰度的分类单元加以区分，以颜色梯度反映样本之间的群落组成相似度。从图5可以看出，主要可以分为自然恢复与种植植物2类， 其中种植植物类可以分为2类，自然恢复根际土壤中丰度较高的微生物属主要有Mycobacterium（分枝杆菌属）、Cryobacterium（喜冷杆菌属）、Caenimonas、Ramlibacter（沙壤土杆菌属）、Gaiella（放线菌属）、

Nitrobacter（硝化菌属）、Nordella（诺德氏菌属）。在轮作制度下，大豆与连种苜蓿相似的属主要有Variibacter（变杆菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Ohtaekwangia、Lentzea（伦茨氏菌属）与Gaiella（放线菌属），但是丰度均不高;在玉米—大豆—大豆轮作制度下，玉米与连种毛苕子根际细菌群落的相似属主要有Pseudoncardia（诺卡式菌属）、Microvirga（微枝形杆菌属）、Aeromicrobium（气微菌属）与Nonomuraea（野野村菌属），丰度也不高。

3 结论与讨论

3.1 不同方法的优点及局限性

传统微生物培养分析法简单、快速、易操作，适用于测定具有特殊生理功能的微生物，然而有许多微生物无法培养，难以测定[15-17];Biolog分析主要通过研究对单一碳源底物利用能力的不同来鉴定微生物群落结构，有方便快速、灵敏度高、分辨率强等优点[18]，可弥补其他方法无法获得微生物群体活性信息的不足[19]，但是培养条件的改变可能会引起微生物对碳底物实际利用能力的改变，从而造成一定的误差，同时目前标准数据库中菌种资料不完善，一些种类不能被准确鉴定，只能得到相似类群[20-21];16S rDNA高通量测序法主要通过提取微生物组总DNA并进行定量，扩增，纯化，测序，从而鉴定微生物菌群结构[22]，但是对于序列相同的不同细菌难以进行鉴定。

3.2 矿区不同植物根际微生物多样性差异

植物影响土壤环境，有研究表明，不同植物根系分泌物的成分与含量不同，植物根际微生物的功能代谢有差异[23]，因此不同植物对土壤微生物群落的影响不同[24]。在本研究中，用传统培养法得到的结果表明，该工矿复垦区不同植物根际微生物数量不同，豆科植物根际微生物细菌、放线菌数量要多于禾本科植物，这可能与豆科植物本身具有较强的固氮能力相关。Biolog技术分析表明，不同植物根际微生物利用碳源能力存在差异性，自然恢复可利用碳源的微生物活性最低，代谢功能最差，可能与复垦初期自然恢复土壤有机质含量低有关，而毛苕子根际微生物活性最高。16S rDNA分析表明，自然恢复根际微生物与种植植物根际微生物差异大，且微生物丰度最高，但是多样性指数低于豆科植物，高于禾本科植物。

3.3 将来的研究方向

本研究区处于工矿复垦初期，矿区生态环境恢复与耕地面积的增加是当地农业可持续发展的关键，在民生福祉的建设中意义重大，因此，需要多种方法与技术相结合并进行长期监测以关注矿区土壤质量的变化，为矿区生态建设提供理论依据。

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