1株耐硒凝结芽孢杆菌的分离鉴定及其培养条件的优化

吴美儒　周毅峰　唐巧玉

摘要：用含硒培养基，采用平板稀释分离法，从湖北恩施渔塘坝高硒环境中分离鉴定1株凝结芽孢杆菌。为确定该凝结芽孢杆菌培养基及培养条件，采用单因素和正交试验法对凝结芽孢杆菌的摇瓶发酵培养条件（碳源、氮源、温度和转速）进行了优化，为确定其培养时间作出了生长曲线。结果表明，温度对凝结芽孢杆菌生长的影响最大，其后依次为氮源、碳源和转速;最适培养基为：葡萄糖11 g/L，牛肉浸膏11 g/L，氯化钠5 g/L;最适培养条件为：温度35 ℃，转速160 r/min;（2）从生长曲线可看出，0～1.5 h为停滞期，1.5～10 h为对数生长期，10～20 h为稳定期，最佳培养时间为10 h。

关键词：硒;凝结芽孢杆菌;分离;培养条件;生长曲线

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0256-04

硒是人体和动物所必需的微量元素[1]，湖北省恩施州是世界著名的典型高硒区，蕴藏十分丰富的硒资源[2]。对硒资源的开发利用目前主要依靠植物对硒的富集作用，得到富硒农产品和含硒提取物如硒蛋白、硒多糖等。微生物作为生物界与人类密切相关的一大类生物群体，利用微生物开发利用硒资源具有广阔的前景。含硒酵母能抑制某些肿瘤细胞的生长[3-4]，提高生物有机体的抗氧化能力[5]。Siddique等分离的细菌能还原矿山尾矿中的硒，从而改变硒的有效性[6]。Zhang等将具有硒还原能力的细菌用于废水处理[7-8]。对于高硒地区土壤微生物，研究比较少。Burton等发现，硒污染地区土壤微生物具有比普通土壤微生物更强的耐受硒的能力[9]。本研究的主要内容是分离筛选高硒环境中的微生物，并通过优化培养基组成和培养条件来提高该耐硒微生物生物量，旨在为进一步对其进行开发利用创造良好的基础条件。

1 材料与方法

1.1 高硒环境中微生物的分离

用取自恩施双河富硒土壤（硒含量为36.8 μg/g）来分离细菌。细菌的分离在含有50 mg/mL的固体细菌培养基上进行，37 ℃培养12 h，选择单菌落进行进一步研究。

1.2 菌株耐硒能力测定

将选择的单菌落菌株分别接种到含0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg/L硒的细菌培养基中，在37 ℃、150 r/min条件下培养24 h，测定D600 nm，选择1株耐硒能力强的菌株进一步研究。

1.3 耐硒菌种的鉴定

选取1株耐硒能力强的菌种进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、接触酶试验、V-P试验、葡萄糖发酵试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验、菌种的耐盐试验等生理生化鉴定试验。根据实验室结果，检索常用细菌鉴定手册[10]，确定该耐硒菌种的种属。

1.4 耐硒菌种培养条件的优化

1.4.1 选定发酵培养基成分 选用葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作为碳源，浓度为10 g/L，氮源用酵母浸出物10 g/L，氯化钠5 g/L，调节pH值为7.0，在37 ℃、转速150 r/min条件下培养14 h后测D600 nm。

选用酵母浸出物、胰蛋白胨和牛肉浸膏作为氮源，浓度为10 g/L，碳源用葡萄糖10 g/L，氯化钠5 g/L，调节pH值为 7.0，在37 ℃、转速150 r/min条件下培养14 h后测D600 nm。

1.4.2 确定碳源和氮源浓度 对选定的碳源做浓度梯度单因素试验，浓度分别为3、7、11、15、19 g/L，氮源酵母浸出物10 g/L，氯化钠5 g/L，调节pH值为7.0，在37 ℃、转速 150 r/min 条件下培养14 h后测D600 nm。

对选定的氮源做浓度梯度单因素试验，浓度分别为3、7、11、15、19 g/L，碳源葡萄糖10 g/L，氯化钠5 g/L，pH值为 7.0，在37 ℃、转速150 r/min条件下培养14 h后测D600 nm。

1.4.3 温度和转速单因素实验 以碳源葡萄糖10 g/L，氮源酵母浸出物10 g/L，氯化钠5 g/L配培养基，pH值7.0，接种后分别在25、30、35、40、45 ℃，转速150 r/min培养14 h后测D600 nm。

以碳源葡萄糖10 g/L、氮源酵母浸出物10 g/L、氯化钠 5 g/L 配培养基，pH值7.0，接种后分别以100、120、140、160、180、200 r/min，37 ℃培养14 h后测D600 nm。

1.4.4 正交试验 根据碳源浓度、氮源浓度、温度和转速的单因素试验结果进行L9（34）正交试验，进一步优化培养条件。试验因素和水平见表1，培养14 h后测D600 nm。

将菌株在正交试验得出的最优组合条件下进行培养，14 h 后测D600 nm，以验证正交试验结果。

1.5 生长曲线的测定

以碳源葡萄糖10 g/L、氮源酵母浸出物10 g/L、氯化钠 5 g/L 配培养基，pH值7.0，在37 ℃、转速150 r/min下分别培养1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h后测D600 nm。

1.6 数据统计与分析

对测定结果的原始数据通过Excel、SPSS软件进行数据的误差分析和t值检验，进行平行组的平均值校正和显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的耐硒能力

从图1可见，选择的8个菌株M3、M7、M9、M12、M13、M18、M20和M22均有一定的耐硒能力。特别是M22菌株，在硒浓度500 mg/L以下时，随着硒浓度的增加，其D600 nm升高;且在硒浓度500 mg/L以上时，D600 nm均高于其他菌株。故本试验选取菌种M22進行菌种鉴定和培养条件优化等研究。

2.2 耐硒菌株鉴定结果

选取菌种M22进行染色和生理生化鉴定试验，根据表2试验结果，检索常用细菌鉴定手册[10]，鉴定该耐硒菌株为凝结芽孢杆菌。

2.3 耐硒菌种培养条件的优化

2.3.1 碳源和氮源对菌株生长的影响 如图2所示，对于碳源的影响，葡萄糖与蔗糖无明显差异，而它们与可溶性淀粉相比对菌体浓度增加有一定的作用，故可选葡萄糖或蔗糖来做单因素试验。但考虑到蔗糖没有葡萄糖好利用，且须要产生蔗糖酶，因此选葡萄糖来做单因素试验。对于氮源的影响，从

胰蛋白胨、酵母浸出物到牛肉浸膏，它们依次对菌体浓度增加有明显的作用，因此选牛肉浸膏来做单因素试验。

2.3.2 单因素试验结果 图3-A为碳源浓度对凝结芽孢杆菌生长的影响，当葡萄糖浓度为7 g/L时，细菌的D600 nm最大，相比于3、11 g/L对D600 nm有显著增加，故选 3、7、11 g/L 3个水平来做正交试验。图3-B为氮源浓度的影响，当牛肉浸膏浓度为7 g/L时，细菌的D600 nm最大，相比于3、11 g/L对D600 nm有极显著增加，故选 3、7、11 g/L 3个水平来做正交试验。图3-C为温度的影响，当温度为30 ℃时，细菌的D600 nm最大，相比于35 ℃对D600 nm有极显著增加，故选25、30、35 ℃ 3个水平来做正交试验。图3-D 为转速的影响，当转速为200 r/min时，细菌的D600 nm最大，故选160、180、200 r/min 3个水平来做正交试验。

2.3.3 正交试验 由表3可知，通过极差分析，温度对凝结芽孢杆菌的生长影响最大，其次依次是氮源牛肉浸膏浓度、碳源葡萄糖浓度、转速。本试验条件下优化水平的最佳组合为A3B3C3D1，即凝结芽孢杆菌的最佳培养条件为葡萄糖 11 g/L、牛肉浸膏11 g/L、温度35 ℃、转速160 r/min。在此条件下培养菌株，其培养液D600 nm为（2.210±0.010），与第9组正交试验相比稍低，这可能与接种的种子液的生长状态和接种量有关。

2.4 生长曲线的测定

从图4可知，0～1.5 h为停滞期，1.5～10 h为对数生长期，当培养时间达到10 h时菌体生长进入稳定期。通过测定生长曲线，了解分离得到的凝结芽孢杆菌在不同时期的生长特征，可以根据不同的实际需要如获得大量细菌个体、获得细菌的初级代谢产物或次级代谢产物来选择不同的培养时间。

3 讨论

从恩施富硒区富硒淤泥中分离鉴定了1株耐硒凝结芽孢杆菌。在基础研究方面，这些菌种的筛选丰富了利用微生物进行生物富硒的研究基础，为硒资源的开发和利用提供了微生物的研究基本材料， 从而进一步对耐硒相关基因做出研究和硒代谢分子机制的研究。在应用研究方面，凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）为革兰氏阳性杆菌，具有耐热性好、耐受胃酸和胆汁等优点[11-12]。芽孢杆菌类益生菌为好氧繁殖，进入人和动物肠道内能消耗大量的游离氧，降低氧化还原电势。对厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长起到促进作用，从而调节肠道内微生态的菌群平衡，提高机体免疫和抗病能力减少肠道疾病的发生;凝结芽孢杆菌在肠道内繁殖的同时分泌消化酶，有助于营养物质的消化和吸收，促进动物生长;其产生的维生素、氨基酸、短链脂肪酸等物质能增加小肠蠕动速度，改善肠道消化功能;产生抑菌物质能对肠道不同诱因的炎症有一定治疗作用[13-18]，可以进一步研究耐硒凝結芽孢杆菌的富硒能力，开发含硒益生菌。

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