添加防腐剂的五氯柳胺混悬液抑菌效力的检测与评价

姜兴粲　李冰　孙继超　王玮玮　张吉丽　 张继瑜

摘要：为了比较添加防腐剂的五氯柳胺混悬液与未添加此类防腐剂的五氯柳胺混悬液的抑菌效力，探讨其防腐剂添加的合理性及必要性，选取未添加防腐剂和原药、未添加防腐剂、添加防腐剂的制剂，采用《中华人民共和国药典》2015版四部1121抑菌效力检查法，以铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌株对其进行抑菌效力测定。结果表明：添加防腐剂的五氯柳胺混悬液均达到《中华人民共和国药典》2015版抑菌效力标准;不添加防腐剂的未能达到抑菌效力标准。可见五氯柳胺混悬液中防腐剂的添加是合理的，不含防腐剂的五氯柳胺混悬液可能存在潜在的风险。

关键词：五氯柳胺;混悬液;防腐剂;抑菌剂效力;评价

中图分类号： S853.74  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0143-03

在国外，五氯柳胺是水杨苯胺类抗寄生虫类药物，对吸虫病具有优良的疗效，主要用于治疗牛羊肝片吸虫病，同时对绦虫和线虫均具有良好的治疗效果。但在国内，五氯柳胺尚无成品制剂上市。本试验对添加防腐剂（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯）的五氯柳胺混悬液的抑菌效力进行了探究。口服制剂在使用过程中容易存在微生物污染问题，《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）允许这类产品添加防腐剂，但是过量的防腐剂存在危害，所以对防腐剂的应用进行评价[1-3]。本试验针对未添加防腐剂的五氯柳胺（主药）和添加防腐剂的五氯柳胺混悬剂的抑菌效力进行考察，探究其防腐剂添加的合理性。

1 试验样品、仪器及试验设计

1.1 供试品

五氯柳胺混悬液（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所自制），考察其抑菌效力情况。

1.2 仪器

隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台、LDZM-60KCS-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、电热恒温鼓风干燥箱、恒温振荡器、优普超纯水制造系统、THOMAS细胞密度计、比色杯（光径为10 mm）、KQ3200DE数控超声波清洗器、BSA423S-CW天平（sartorius）、烧杯、三角瓶等。

1.3 培养基及试剂

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（产品批号：1073051）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）（产品批号：1073051）、胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）（产品批号：1073191）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（产品批号：1072401）均来自广东环凯微生物科技有限公司;培养基适用性检查结果符合中华人民共和国药典要求;对羟基苯甲酸甲酯（批号：20180118）和对羟基苯甲酸丙酯（批号：20130830）购自国药集团化学试剂有限公司，氯化钠（批号：L218041910）购自四川科伦药业股份有限公司。

1.4 菌种

大肠埃希菌（E. enteritidis）[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]菌种均来自中国食品药品检定研究院[1-5]。

1.5 试验设计

参照《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）四部附录通则[2]1105中“微生物学计数法”对五氯柳胺混懸液计数方法进行方法适用性试验[1]。根据试验结果，按照抑菌剂效力检查法（《中华人民共和国药典》2015年版四部1121抑菌效力检查法）对样品进行抑菌剂效力测定[4-11]。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

参照“《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）四部1121抑菌效力检查法”的方法进行菌液制备[1]。采用适宜方法制成含菌量约为107～108 CFU/mL的菌悬液，备用[9-19]。

2.2 计数方法的适用性

2.2.1 平皿法 取供试液，加入小于供试液体积1%的菌悬液，使每1 mL供试液中含菌量不大于100 CFU，混匀后取 1 mL 置直径90 mm的无菌平皿中，用于细菌培养的平皿注入20 mL温度不超过45 ℃的胰酪胨大豆琼脂培养基，用于真菌培养的平皿注入20 mL温度不超过45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，按规定条件培养，计数[1，20-22]。

2.2.2 计数方法 回收率计算公式为：回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数，5种试验菌回收率均高于90%，结果（表1）表明该方法可用于该供试品试验。

2.3 抑菌效力测定

取供试品转移至带塞塑料管中，每管50 mL，混匀，作为供试品溶液备用。同法制备5份。分别取菌液制备中的菌悬液（或孢子悬液）0.5 mL接种于上述供试品溶液中，每个容器接种1种试验菌，混合，使供试品溶液中的试验菌均匀分布[1]。在试验期间，接种的供试品溶液置25 ℃培养箱中避光贮存。根据《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1121“抑菌效力检查法”抑菌剂效力，按口服制剂规定的间隔时间，分别从每个接种过的供试品容器中取供试品1 mL，用09%氯化钠进行10倍倍比稀释，对各稀释级按相应的微生物计数方法进行操作。根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始菌数lg值减少程度进行评价[23-27]。

2.4 抑菌效力评价标准

五氯柳胺混悬液抑菌效力评价标准按照《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）四部通则1121“抑菌效力检查法”中口服制剂的抑菌效力判断标准[1]。该判断标准分为A、B 2个标准，“A”是指应达到的抑菌效力标准，特殊情况下，如抑菌剂可能增加不良反应的风险，则至少应达到“B”的抑菌效力标准，满足《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）四部通则中抑菌效力检查法对口服制剂和直肠给药制剂抑菌效力的规定，与接菌量比较，14 d细菌数下降均不小于3lg值，真菌数下降均不小于1lg值，28 d细菌和真菌数对前一个测定时间增加的数量不超过0.5 lg值[1，25-30]。

2.5 未添加防腐剂和原药、添加防腐剂的制剂及主药（未添加防腐剂）的抑菌效力结果

未添加防腐剂和原药的五氯柳胺混悬液抑菌效力结果见表2。添加防腐剂五氯柳胺混悬液制剂抑菌效力结果见表3。主药（未添加防腐剂五氯柳胺混悬液）抑菌效力结果见表4。

3 讨论

3.1 处方分析

主药五氯柳胺对革兰氏阳性菌特别是金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，对部分革兰氏阴性菌也有一定的抑制作用，对霉菌的抑菌作用较弱。防腐剂（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯）对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及霉菌都有一定的抑制作用。五氯柳胺与防腐剂配合使用后，具有较为理想的广谱抗菌作用[12]。

3.2 抑菌效力结果分析

表2表明未添加防腐剂和原药的五氯柳胺混悬液在进行抑菌效力测试中，细菌中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌14 d菌数下降大于2.0lg，但是均达不到《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）的要求;真菌中黑曲霉 14 d 菌数下降大于0.5lg且小于1.0lg，可知其不符合《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力标准。表3表明添加防腐剂的五氯柳胺混悬液制剂在进行抑菌效力测试中，细菌和真菌14d菌数下降大于3.0lg，28 d未恢复生长，从测试结果得出其符合《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力标准。表4数据显示，主药进行抑菌效力测试中，细菌：14d菌数下降只有金黄色葡萄球菌大于30lg，且28 d时未恢复生长;大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 14 d 菌数下降大于20lg，小于3.0lg， 虽然 28 d 时未恢复生长，但未能达到《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）的14 d抑菌效力标准。真菌：白色念珠菌和黑曲霉14 d下降均小于1.0lg，未能达到《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力标准[1]。

3.3 添加防腐剂的必要性

防腐剂可以用于抑制微生物的生长繁殖，防止微生物污染而影响产品质量。若药品制剂不具有足够的抑菌作用，为了防止药品制剂在使用中发生微生物污染，产生危害，在药品制剂中应加入合适的防腐剂，特别是口服液这样的药品制剂[12，31]。《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）中抑菌效力检查法项下规定，用于存活菌数测定的方法，其方法适应性验证试验菌的回收率不得低于70%。本次测试中不添加防腐剂（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯）的五氯柳胺混悬液未能达到《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力标准。抑菌效力检查结果证明，在五氯柳胺混悬液处方中加入防腐剂可达到《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）抑菌效力要求[1]。

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