1株拮抗链格孢的芽孢杆菌的筛选鉴定和抑菌效果

刘伟　王多文　何彩　李强　史星雲　刘鹏

摘要：以链格孢（Alternaria spp.）为靶标菌从农田土壤中分离到1株芽孢杆菌。通过形态学特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等对菌株进行鉴定。结果表明，菌株LKYLW-1为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus，GenBank登录号为MF375905）;对链格孢的抑菌带宽为15.8 mm;采用菌丝生长抑制法、孢子萌发法测定LKYLW-1的抑菌作用，发现菌株LKYLW-1代谢产物对链格孢丝有致畸作用;菌株LKYLW-1发酵液对孢子萌发抑制率为96.60%;EC50为6.93 mL/L;饱和度为25%;硫酸铵获得的抑菌物质对链格孢的抑菌活性较高，抑菌圈直径达42.01 mm。

关键词：芽孢杆菌;抑菌活性;拮抗;链格孢属靶标真菌;形态学特征;生理生化分析;16S rDNA序列分析

中图分类号： S476;S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0091-03

多种作物的黑斑病是由链格孢属真菌（Alternaria spp.）引起的[1]，链格孢属真菌会导致作物产量和品质受到严重影响，链格孢属真菌同时也是蔬菜贮藏过程中的主要病害菌，能引起多种瓜果、蔬菜的腐败，造成了巨大的经济损失[2]。使用农药能暂时控制黑斑病的大面积传播，然而其副作用也引起了人们的重视。

生物防治因其对人畜安全、环境兼容性好、而且不易产生抗药性而倍受关注。王继华等从冷冻菌种甘油中分离到1株芽孢杆菌，能产生抑制链格孢真菌的物质[3];赵阳国等从土壤中分离出1株枯草芽孢杆菌，该菌对农林业危害真菌链格孢菌具有强烈的抑制作用[4]。芽孢杆菌防治植物病害的作用机制主要有与病原菌竞争营养和生态位点、分泌抗菌物质抑制病原菌的生长以及激发植物系统抗病性[5]。本研究通过形态学特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等方法，鉴定出1株从农田土壤中分离到的芽孢杆菌，能够强烈抑制链格孢属真菌的生长。

1 材料与方法

1.1 材料

供试链格孢：本研究用菌由甘肃省酿酒葡萄苗木快繁工程技术研究中心葡萄病理实验室保存、提供。

土壤样品：从甘肃省武威市林業科学研究院采集农田土壤30份。

培养基：溶菌肉汤（LB）固体培养基用于分离和保存分离的芽孢杆菌;LB液体培养基用于发酵分离芽孢杆菌;马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于对峙培养。

试验时间：2016年8月。

1.2 方法

1.2.1 土壤拮抗芽孢杆菌的分离和筛选 芽孢杆菌的分离采用稀释涂布法[6]。将采集的土样称取10 g，加入装有 90 mL 无菌水并放有玻璃珠的250 mL锥形瓶中，80 ℃水浴30 min，再充分振荡30 min，10倍倍比稀释，涂布分离。纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、G+的分离物为芽孢杆菌。将分离得到的芽孢杆菌进行编号，观察菌落形态。

采用平板对峙法进行拮抗芽孢杆菌的筛选，将已培养3 d的链格孢用5 mm打孔器打孔，将菌饼移到PDA培养基中央，28 ℃培养24 h后，在离真菌等距离的四周接上待测芽孢杆菌，28 ℃培养4 d后，测量抑菌带的宽度，筛选效果最好的1株芽孢杆菌进行研究[7-8]。

1.2.2 拮抗芽孢杆菌的抑菌活性测定 对链格孢菌丝影响的研究采用平板对峙法[9]，在PDA平板中央接链格孢菌饼，在距离中心3 cm的两侧接种培养48 h且生长良好的拮抗芽孢杆菌，28 ℃倒置培养4 d。观察靠近芽孢杆菌抑菌圈边缘菌丝的生长情况，以远离拮抗芽孢杆菌的边缘菌丝为对照，显微观察菌丝的生长情况。

拮抗芽孢杆菌无菌发酵滤液的制备：将发酵液经 10 000 r/min 离心过滤，0.22 μm滤膜过滤除菌得到无菌发酵液。将链格孢孢子制备成孢子悬浮液（400倍显微镜下，每个视野中可看到20个孢子），将制备好的拮抗芽孢杆菌无菌发酵液与病原菌孢子配制成0、50、100、200、500 mL/L系列浓度的孢子悬浮液，以清水为对照，每个处理3次重复。28 ℃恒温培养8～10 h，检查对照处理的孢子萌发情况（以孢子芽管长度大于孢子短半径时判为萌发），孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发 率×100%[10-11]。

1.2.3 拮抗芽孢杆菌的鉴定

1.2.3.1 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定参照柳凤等的方法[12]。

1.2.3.2 16S rDNA基因序列测定及其系统进化树的构建参照Todorov等的方法[13] 提取细菌基因组DNA为模板，以7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]为上、下游引物，扩增菌株的16S rDNA。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送往该公司进行序列测定，测序结果用Blast软件在GenBank中进行同源性比较，并提交注册登录号，进行序列分析。

1.2.4 拮抗芽孢杆菌抑菌物质的提取 将拮抗芽孢杆菌LKYLW-1接种到LB液体培养基中，对照为LB液体培养基，28 ℃、150 r/min振荡培养24 h，10 000 r/min离心 20 min，去菌体，加入不同质量浓度的硫酸铵，使硫酸铵饱和度分别为10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，4 ℃下静置沉淀24 h，弃上清，沉淀用25 mmol/L磷酸缓冲液溶解，透析脱盐后与链格孢对峙培养，5 d后用滤纸片法[14]测定抑菌圈大小。

1.2.5 数据分析 采用SPSS 16.0软件、Duncans方法对所有数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗芽孢杆菌的筛选结果

2.1.1 拮抗芽孢杆菌的筛选 从甘肃省武威市林业科学研究院农田30份土壤中，分离得到151株芽孢杆菌。经链格孢筛选后，得到抗链格孢活性较强的芽孢杆菌3株，其中LKYLW-1菌株对链格孢的拮抗活性较好，抑菌带宽为 15.8 mm，如图1所示。故后续试验均以LKYLW-1菌株为拮抗菌。

2.2 LKYLW-1的抑菌活性

2.2.1 对链格孢菌丝生长的影响 图2结果显示，对照菌丝生长细长而均匀，细胞结构较为清晰，并无膨大畸形现象（图2-a）。LKYLW-1菌株主要使菌丝体膨大变粗，生长畸形，菌丝顶端和分枝处较为膨大;菌丝分枝增多，粗而短;菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀，浓缩成不规则体，部分菌丝内有原生质流出形成空壳的现象（图2-b）。

2.2.2 对链格孢孢子萌发的抑制作用 由图3可知，无菌发酵液对孢子萌发有明显的抑制作用，孢子萌发抑制率为 96.60%，EC50为6.93 mL/L。

2.2.4 LKYLW-1菌株的鉴定

2.2.4.1 菌株LKYLW-1培养性状、形态学特征及生理生化特征 在LB固体培养基上，LKYLW-1菌落呈乳白色、不透明、菌落光滑、中间凹陷、边缘隆起。透过电镜显示 LKYLW-1 呈杆状，长约2 μm，革兰氏阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形（图4）。将菌株LKYLW-1的形态特征和生理生化特性（表1）与《常用细菌系统鉴定手册》中有关细菌的描述进行比较，确定此菌株为芽孢杆菌属，菌株基本可以确定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。

2.2.4.2 16S rDNA序列分析 以LKYLW-1基因组DNA为模板，用引物7f和1 540r进行PCR扩增，测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1 492 bp，GenBank登录号为MF375905。将该序列与GenBank中的相关数据进行相似性分析，结果表明，与亲缘关系相近的前100个序列全为芽孢杆菌属;前20个序列中， 有13株为萎缩芽孢杆菌菌株;且菌株LKYLW-1与它们都具有99%以上的同源，其中与萎缩芽孢杆菌（登录号：CP022653.1、CP021500.1、KR085882.1、CP011802.1、CP010778.1、CP007640.1、KF751643.1、CP002207.1）的同源性最高，达到了100%。综合生理生化特征将其鉴定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）LKYLW-1。

2.2.5 LKYLW-1菌株的抑菌物质对链格孢的抑菌活性 由表2可知，菌株LKYLW-1能够分泌胞外抑菌物质，在硫酸铵饱和度≥35%时无沉淀析出，即对链格孢无抑菌活性，而硫酸铵饱和度为10%～30%时，获得的抑菌物质对链格孢均具有抑菌活性，但抑菌活性不同。其中，硫酸铵饱和度为25%时获得的抑菌物质抑菌圈直径最大，即抑菌活性最高，抑菌圈直径达42.01 mm（图5）。

3 结论与讨论

本研究从农田土壤中分离筛选出拮抗芽孢杆菌，一方面增大了成功筛选出拮抗菌的可能性，另一方面将其施用于作物时无毒无害。芽孢杆菌是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌，有些还能抑制霉菌、革兰氏阴性菌和酵母[15]。本研究中LKYLW-1菌株在距离链格孢中心3 cm的2侧接种培养48 h后，可使菌丝体膨大变粗，生长畸形;菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀，浓缩成不规则体，部分菌丝内有原生质流出形成空壳的现象，最终可能会导致菌丝不能正常分化产生孢子，影响其繁殖，不过抑菌机制还需要进一步研究。

本研究的目的是通过筛选找到对链格孢有明显拮抗作用的菌株，并对其进行初步研究，拓宽了链格孢拮抗菌的筛选范围，为今后链格孢引起的病害生物防治奠定了基础。今后将对菌株LKYLW-1进行深入研究，包括发酵条件优化，拮抗蛋白的分离、提取，以及拮抗蛋白的纯化测序等，使其商品化生产。

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