豆制品转基因检测中不同DNA提取方法的比较

孙梦梦　黄欢欢　沈晓芳　庞月红

摘要：高品质的DNA是分子生物学研究的关键，大豆及豆制品中含有较多的蛋白质、酚类、糖类和脂类物质，从中提取高品质的DNA比较困难。拟采用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）法、改良CTAB法、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）法、SDS-聚乙烯吡咯烷酮（简称SDS-PVP）法和TIANGEN试剂盒法对大豆MON 89788、小黄豆、豆腐及大豆油中的DNA进行提取，对试验过程中的蛋白酶K、RNA酶A的浓度进行优化，并对DNA浓度及纯度进行综合分析。结果表明，对于大豆MON 89788、小黄豆和豆腐，用SDS法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右，DNA产量最高，用改良CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右，用TIANGEN试剂盒法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.75左右，2种方法的DNA产量均比SDS法低，而用 SDS-PVP 法与CTAB法提取的DNA含有较多杂质。综合分析可知，大豆油的最佳DNA提取方法为改良CTAB法。

关键词：大豆MON 89788;豆制品;DNA提取;琼脂糖凝胶电泳

中图分类号： S188  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0047-04

大豆及豆制品是全球食用油及植物蛋白的重要来源，为了提高大豆的产量，满足人们对大豆的需求量，科研人员采用基因工程与分子辅助育种方法，培育了一些优质、高产和抗逆的转基因大豆品种[1]。据报道，我国的大豆需求量从1990年的1 100万t增加到2015年的9 300万t，但是我国的大豆总产量远不能满足国内需求，从1996年起，我国成为大豆的净进口国，进口量从当年的111万t持续增加到2015年的8 169万t[2]。目前我国进口的大豆主要来自美国、巴西、阿根廷这3个国家，而这3个国家出口的大豆基本上为转基因大豆[3]。由于公众对转基因食品的食用安全性和生态安全性认识存在争议，部分国家和地区对转基因作物提出了标签化管理的要求。为保障广大消费者的知情权和选择权，建立准确、快速的转基因检测方法至关重要[4-5]。基因检测技术，尤其是聚合酶链式反应（PCR）[6-9]，已被广泛用于食品生物安全检测等领域。然而，基因组DNA的提取是基因检测技术研究的基础[10]，由于大豆及豆制品中含有较多的多糖、酚类物质，在提取DNA时首先要考虑如何去除多糖、多酚等干扰PCR效果的物质，从而在某种程度上增加了大豆DNA提取的困难程度[11-12]。因此，如何从大豆及豆制品中获得高质量的DNA是后续食品检测成功与否的关键[13-15]。

本试验采用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）法、改良十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）法、CTAB法[16-18]、SDS-聚乙烯吡咯烷酮（简称SDS-PVP）法及TIANGEN试剂盒法提取大豆MON 89788、小黄豆、豆腐、大豆油中的DNA，通过比较浓度、纯度等指标，筛选出适合大豆及豆制品DNA提取的方法，以期为后续的分子生物学分析及标签化管理奠定基础。

1 材料与方法

本试验于2016年11月至2017年5月在江南大学食品学院食品质量与安全中心进行。

1.1 材料与试剂

小黄豆、豆腐、大豆油均购于江苏省内的欧尚超市;MON 89788大豆为转基因大豆品种，购于AOAC（美国分析化学家协会）。

CTAB提取缓冲液（pH值为8.0）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，简称PBS）、SDS提取/裂解缓冲液、TE缓冲液（pH值为8.0）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，简称EDTA）溶液（pH值为 8.0，0.5 mol/L）、改良CTAB提取缓冲液，均由国药集团化学试剂有限公司提供;核酸序列和marker，购于生工生物工程（上海）股份有限公司;TIANGEN试剂盒，购于北京TIANGEN公司;蛋白酶K、RNA酶A，购自碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外分光光度计，日本岛津公司;T 100TM PCR仪，美国Bio-Rad公司;Tanon 6600全自动凝胶成像仪，上海天能公司;高速冷冻离心机，美国Thermo公司;TGL-16G高速离心机，上海安亭公司;SHA-B恒温振荡器，常州国华电器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

1.3 DNA提取方法

根据所用方法配制相应的抽提缓冲液，其中SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法参照农业部1485号公告-4-2010《转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化》，TIANGEN试剂盒按照说明书进行试验操作，将提取出的DNA放入冰箱，待后续检测使用。

1.4 酶的优化

以大豆MON 89788为样品，对不同DNA提取方法中蛋白酶K、RNA酶A的浓度进行优化，TIANGEN试剂盒按说明书进行操作不作此优化，用紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，得出蛋白酶K、RNA酶A的最佳浓度。

1.5 DNA的浓度和纯度

用紫外分光光度法鉴定DNA的浓度、纯度：取10 μL DNA提取液稀释300倍，测定试验样品在260、280 nm下的D值，用D260 nm/D280 nm值判断各样品中的DNA纯度，并计算DNA的浓度。DNA濃度计算公式如下：

DNA质量浓度（ng/μL）=50 ng/μL×D260 nm×稀释倍数。

根据SN/T 1195—2003《大豆中转基因成分的定性PCR检测方法》，选择不同提取方法及不同样品的基因组DNA对大豆的Lectin基因进行核酸定性PCR扩增。PCR反应循环参数：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40个循环;72 ℃ 7 min，4 ℃保存。Lectin基因的PCR引物信息见表1。

吸取5 μL经PCR扩增的DNA提取液，与2 μL上样缓冲液充分混合，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳时间为 40 min，电压为100 V，电泳结果在紫外灯下进行观察、拍照。吸取5 μL稀释100倍的DNA提取原液，重复上述步骤。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶K、RNA酶A的浓度优化

大豆及豆制品中的蛋白质含量丰富，蛋白酶K具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用，可以使DNA更好地被释放出来，所以本试验优化了蛋白酶K的添加浓度。如图1所示，不同浓度的蛋白酶K对提取的DNA纯度有较大影响，在不添加蛋白酶K或蛋白酶K浓度为5 mg/mL时，D260 nm/D280 nm值在1.7以下，说明蛋白质污染严重;当蛋白酶K浓度越来越大时，D260 nm/D280 nm值越来越接近1.8;当蛋白酶K的浓度超过 20 mg/mL 后，D260 nm/D280 nm值再次降至1.7以下，说明又存在蛋白质污染。出现这些结果的原因，是由于蛋白酶K本身也是蛋白质，如果加入浓度过高，也会造成蛋白质污染。所以，本试验选择15 mg/mL为最佳蛋白酶K浓度。

在DNA的提取过程中如果有RNA污染，会影响试验结果，RNA酶A对RNA有水解作用，本试验优化了RNA酶A的添加浓度。如图2所示，当不添加RNA酶A或RNA酶A浓度≤4 mg/mL时，D260 nm/D280 nm值在1.9以上，说明RNA污染严重;随着RNA酶A的浓度增大，D260 nm/D280 nm值越接近1.8; RNA酶A浓度在达到8 mg/mL之后，随着RNA酶A浓

度的增大，D260 nm/D280 nm值趋于稳定。所以，本试验选择 8 mg/mL 为最佳RNA酶A浓度。

2.2 5种方法提取不同样品DNA纯度、浓度的鉴定

用SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法和TIANGEN试剂盒法提取大豆MON 89788、小黄豆、豆腐以及大豆油中DNA的纯度如图3所示。当D260 nm/D280 nm在1.7以下时，表示有蛋白质污染，当D260 nm/D280 nm在1.9以上时，表示有RNA污染，D260 nm/D280 nm在1.8左右时，表示得到高纯度的DNA[19]。对大豆MON 89788及小黄豆样品采用SDS法、改良CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右， 表

明用SDS法、改良CTAB法提取大豆DNA的质量好，纯度较高。豆腐属于深加工产品，在加工过程中经过热处理并加入不同物质等，会使DNA发生不同程度的降解，所以在5种方法下，DNA的提取纯度均有所下降，用SDS法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值为1.8，其他方法的D260 nm/D280 nm值为1.7左右，表明SDS法的提取效果最好。大豆油经过较为复杂的精炼过程，其中的DNA在一定程度上损失了，使得大豆油DNA的提取较困难，因此大豆油DNA最适合用改良CTAB法提取。

由图4可以看出，用5种方法提取大豆MON 89788、小黄豆、豆腐DNA浓度的结果显示，SDS法提取的DNA浓度明显优于其他方法，SDS-PVP法的效果最差。这主要由于SDS是一种阴离子去污剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时，SDS会与蛋白质、多糖结合成复合物，释放出核酸，使得DNA得率较高，通过三氯甲烷及酚溶液抽提、盐溶液浓度增加去除杂质，能够得到高质量的DNA。PVP是高分子表面活性剂，PVP的加入增加了提取反应体系中的黏稠性，部分DNA被吸附从而使提取的DNA含量降低。5种方法提取的豆腐DNA浓度明显比大豆MON 89788、小黄豆样品的低，这是由于豆腐在深加工过程中，部分DNA被破坏而损失。

2.3 琼脂糖凝胶电泳检测

选择大豆Lectin基因验证所提取的DNA是否能够满足后续PCR检测的需要。对不同样品的不同提取方法提取得到的DNA进行Lectin基因PCR扩增，如果提取得到的DNA中有蛋白质、多糖、RNA等杂质污染，这些杂质就会遏制PCR反应，出现假阴性结果[20]。图5为其中最佳的2种方法（SDS法和改良CTAB法）的PCR产物凝胶电泳结果，可以看出，模板DNA都扩增正常，说明所提取的DNA没有被污染，纯度较高。由于不同试验样品的DNA都能够扩增出比较鲜明、条带

大小约为118 bp的DNA条带，与所需终产物的片段大小一样，结论可靠，因此可知，SDS法和改良CTAB法可以用作DNA的提取方法。

由图6的2种方法（SDS法和改良CTAB法）对不同样品的基因组DNA完整性凝胶电泳结果可以看出，使用SDS法、改良CTAB法都能得到DNA条带，用SDS法提取的大豆MON 89788、小黄豆和豆腐的基因组DNA条带更清晰，更完整。由于大豆油的提取效果较差，因此基因组DNA条带不清晰。此外，1号点胶孔处亮度较高，表明有少许蛋白质污染。综上可以看出，SDS法的提取效果最佳。

3 总结与展望

本试验以大豆MON 89788、小黄豆、豆腐、大豆油为样品，研究SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法及TIANGEN试剂盒法提取DNA的效果，旨在选出简单、快捷、高品质的DNA提取方法。试验结果显示，对于大豆及豆腐样品，SDS法提取DNA的浓度及纯度最佳，改良CTAB法和TIANGEN试剂盒法的效果次之;如果对DNA纯度和浓度要求不高且需要快速提取，可以考虑TIANGEN试剂盒法;对于大豆油DNA提取的最佳方法为改良CTAB法。在DNA提取过程中应该尽量简化操作步骤，这样可以减少对基因组的损伤和操作过程中污染的可能性。目前，適合大豆油DNA提取的方法较少且提取的DNA产量不高，有待于进一步探索更有效的DNA提取方法。

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