异氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后P13—K/AKT信号通路的影响

张竞超 张伟晶 周晓娜

【摘 要】目的：探讨异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用机制与磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PI3-K/AKT）信号通路的相关性。方法：将36只SD雄性大鼠按随机数字表法分为3组：假手术组、模型组及异氟烷组。采用线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞模型，缺血2h再灌注24h后进行神经功能缺损评分。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测脑梗死面积，免疫组化法检测PI3-K、p-AKT表达。结果：与模型组比较，异氟烷组神经功能缺损程度明显减轻，脑梗死体积明显减少，PI3-K、p-AKT阳性细胞表达明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：异氟烷通过激活PI3-K/AKT信号通路，从而抑制神经细胞凋亡可能是其对脑缺血-再灌注损伤的保护作用机制之一。

【关键词】异氟烷；脑缺血再灌注；PI3-K、AKT

【中图分类号】R79 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2019）15-0-01

越来越多的研究证实可吸入麻醉剂的预处理能降低缺血再灌注损伤，在一定程度上修复神经功能，但目前异氟烷预处理的脑保护机制尚不明确[1]。异氟烷（ isoflurance，ISO） 是临床常用的挥发性麻醉剂，可诱导新生鼠和成年鼠脑的预处理效果[4]。ISO 的预处理在围手术期可降低脑卒中的发生率，在确保麻醉效果的同时最低程度影响患者脑功能。该研究通过大鼠动物模型神经功能评分、脑梗死面积测定以及PI3-K/AKT的表达率，初步揭示ISO 脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康的成年雄性 SD 大鼠共 36只，重约 250～280 g。依照随机分组原则将其分成分为假手术组、模型组及异氟烷组，每一组分别包括 12只大鼠。大鼠在进行神经缺损评分后，每组动物中再次按随机原则选出 6只进行脑切片的TTC染色，余下6只行免疫组织化学检测。

1.2 挥发性麻醉药预处理

首先将麻醉机回路和大鼠麻醉箱进/出气口连接，然后以5L/min氧流量流经异氟烷蒸发罐，蒸发罐开启浓度为3%，含麻醉药气体流经麻醉箱，出气口连接Solar8000M型麻醉气体监测仪，待箱内异氟烷浓度达1.0MAC，且稳定10min后将大鼠置入，持续吸入麻醉20min后待大鼠肺内麻醉药浓度和箱内平衡后，迅速从箱内取出大鼠并将其口鼻部置于相同浓度的大鼠面罩内维持麻醉。

1.3 TTC 染色步骤：

深度麻醉大鼠，经心脏灌注 PB（100mL），斷头取脑，将脑 组织在 4℃的生理盐水中冰冻 5min 后，由前极向后沿冠状面切 2mm 切片，将切片置于2%TTC 的 0.2PBS 中，PH：7.4，37℃避光孵育 30min，每间隔 5nin 轻柔晃动平皿，然后将 TTC 液倒出，在 PBS 中洗三次，每次 1min，最后在 4%的多聚甲醛中固定，相机拍照。

1.4 神经功能评分

使用 Zea-longa 5 分制法，对大鼠神经功能缺损症状行量化评分。评分标准： 0 分，未观察到神经功能缺损的表现； 1 分，手术对侧前腿不能完全伸直； 2分，爬行路径中向手术对侧转圈； 3 分，爬行过程中向手术对侧歪倒； 4 分，未观察到有自发行走，伴或不伴意识障碍； 5分，死亡。评分为 1～3 分且无蛛网膜下腔出血者被视作模型制作成功，纳入实验。

1.5 免疫组织化学染色

脑片经脱蜡、脱水，PBS 液漂洗，进行抗原修复，双氧水封闭，山羊血清封闭，后加入一抗，4 ℃ 孵育过夜； 次日，室温复温 30 min，移去一抗，PBS 液漂洗，滴加二抗（ 山羊抗兔 Ig G） ，置于 37 ℃ 温浴箱中 20 min后，PBS 液漂洗，经过在 37 ℃ 温箱中的避光孵育 20 min，PBS液漂洗，DAB显色，脱水透明封片。阴性对照用浓 度为0.01 mol / L PBS 液代替一抗。镜下观察，PI3-K、p-AKT阳性细胞的胞核部分和胞浆部分呈现出棕黄色，记录 PI3-K、p-AKT阳性细胞占整个视野的比例。

1.6 统计学处理

采用SPSS16.0软件进行统计处理，实验结果数据均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，显著性水准取α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠神经功能缺损评分

模型组和异氟烷预处理组的大鼠在脑缺血再灌注后，神经系统症状主要表现为： 左前肢不能完全伸展； 爬行时由于左侧肌力下降。模型组与异氟烷预处理组分别与假手术组相比，评分均较高（ P< 0.01） ； 异氟烷预处理组与模型组相比，评分低于模型组（ P<0.05） （见表1）。

3 讨论

现代医学研究认为，急性脑缺血的病理机制主要与兴奋性氨基酸、细胞内钙离子

超载、氧自由基、炎症反应等因素有关[2]。PI3-K/AKT该信号通路参与了脑缺血的病理过程，而且在缺血早期即给予外源因子提高AKT的表达可以减少缺血脑组织的损伤[3]。PI3-K/AKT 信号转导通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，在心脏、肾脏、 肝脏等多种器官缺血再灌注损伤中发挥抑制细胞凋亡作用。本实验结果示，模型组大鼠脑缺血再灌注后形成脑梗死灶，脑组织中PI3-K、AKT表达率较假手术组显著增高，这说明PI3-K、AKT参与了缺血再灌注损伤过程。

综上所述，经异氟烷预处理后，大鼠神经功能评分显著降低，损伤程度更小。脑组织PI3-K、AKT表达率较假手术组显著增高。可见，异氟烷预处理通过上调PI3-K、AKT信号通路发挥对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。

参考文献

饶明俐，林世和.脑血管疾病.人民卫生出版社，2002.172.

陈捷.缺血性脑卒中的流行病学.实用心脑肺血管病杂志.2000，8（3）179-181.

程倚萌，托毗醋对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡的影响：[学位论文]郑州：郑州大学，2007；[l]吴江神经病学.北京：人民卫生出版社，2005，153-159.